论文发表 | 论文范文 | 公文范文
最新公告:目前,本站已经取得了出版物经营许可证 、音像制品许可证,协助杂志社进行初步审稿、征稿工作。咨询:400-675-1600
您现在的位置: 新晨范文网 >> 农业杂志 >> 养殖杂志 >> 今日养猪业杂志 >> 正文

槲皮素改性脱细胞猪真皮基质的探究

定制服务

定制原创材料,由写作老师24小时内创作完成,仅供客户你一人参考学习,无后顾之忧。

发表论文

根据客户的需要,将论文发表在指定类别的期刊,只收50%定金,确定发表通过后再付余款。

加入会员

申请成为本站会员,可以享受经理回访等更17项优惠服务,更可以固定你喜欢的写作老师。

摘要:采用不同浓度的槲皮素(QCT)交联改性脱细胞猪真皮基质(pADM),并对改性后的脱细胞猪真皮基质(QCT-pADM)材料进行傅里叶红外光谱、DSC、TG、表面形貌和耐降解性能等表征。结果显示,槲皮素的引入不会改变pADM中胶原的三股螺旋结构;改性后脱细胞猪真皮基质材料纤维编织更为紧实,热稳定性能得到提升,耐酶解性能和亲水性能大幅提高。

关键词:槲皮素;脱细胞猪真皮基质;交联

前言

脱细胞猪真皮基质(Porcineacellulardermalmatrix,pADM)是通过物理、化学、生物学等方法将猪真皮组织去除皮内具有免疫原性的全部细胞成分后得到的一种胶原材料,其保留了组织中的胶原(纤维)成分和组织基本结构且具有三维空间结构。pADM具有良好的生物相容性、可促进细胞生长繁殖、生物降解性优良等特点,在生物医学材料领域获得日益广泛的应用,但力学性能不足、耐降解性能差等缺点限制了其发展。因此,对pADM的适当改性尤为重要。化学交联可在一定程度上封闭pADM的抗原位点,降低pADM的免疫原性,常用的化学交联剂有戊二醛、碳化二亚胺、环氧化合物、京尼平等[1-3]。然而,化学交联剂可能因为反应不完全或纯度不够而向材料中引入一定的杂质使得材料生物相容性下降。天然的提取产物可避免化学交联剂毒性较大等问题。肖世维等[4]采用原花青素对pADM进行交联,交联后材料的机械力学性能增强,热变性温度升高,亲水性能增加,同时材料无明显急性毒性。槲皮素(Quercetin,QCT)是一种类黄酮醇,微溶于水,溶于乙醇、冰醋酸等溶剂中,以糖苷形式存在于蔬菜、瓜果等植物中。槲皮素独特的分子结构使其具有多面的药理功能和生物活性,具有抗菌消炎作用、抗氧化作用、抗肿瘤作用等[5]。槲皮素与原花青素分子结构类似,仅在4位多1个O原子(羰基O),具有邻苯二酚、间苯二酚结构。吕昔琴等[6]采用槲皮素对心脏瓣膜进行交联改性,改性的材料力学性能得到明显提升,耐酶降解性能和细胞相容性提高,同时材料具有很强的抗钙化能力。但以槲皮素作为天然交联剂交联pADM还未有报道。本文主要采用不同浓度的槲皮素对脱细胞猪真皮基质进行交联改性,旨在了解槲皮素对pADM结构和性能的影响,以探讨槲皮素作为pADM交联剂的可能性。

1试验部分

1.1主要仪器及试剂

1.1.1主要仪器精密分析天平(FA2004N),上海菁海仪器有限公司;冷冻干燥机(Freeze6),Labconco公司;万能电子拉力机(GT-AL-7000S),高铁检测仪器有限公司;傅里叶变换红外光谱仪(NicoletIS10),美国ThermoScientific;差示扫描量热仪(DSC-200PCPHOX),Netzsch公司;扫描电子显微镜(S3000N),Hitachi公司;热重分析仪(TG209F1),Netzsch公司;超声波清洗器(KH5200DE),昆山禾创超声仪器有限公司。

1.1.2主要试剂脱细胞猪真皮基质,江阴奔翔生物科技有限公司;槲皮素,BR,国药集团化学试剂有限公司;茶树油,BR,国药集团化学试剂有限公司;I型胶原酶,BR,赛默飞世尔生物化学制品有限公司;其他试剂均为分析纯,成都科龙化工试剂厂提供。

1.2试验方法

1.2.1QCT-pADM材料制备准确称取400mg槲皮素(QCT)溶解于20mL无水乙醇中,超声15min,得到均一溶液;然后用无水乙醇分别配制成1、2.5、5、10和20mg/mL溶液;准确称取2g脱细胞猪真皮基质(pADM)分别浸在QCT溶液中,在37℃、持续摇动的条件下(r/min=120)进行交联24h;反应结束后,将其用蒸馏水清洗5次后,冷冻干燥,制得QCT-pADM材料。1.2.2QCT-pADM材料性能表征

1.2.2.1傅里叶变换红外分析分别刮取少量QCT-pADM纤维,与适量KBr共混,研磨均匀后压片,在傅里叶变换红外光谱分析仪上进行扫描。扫描条件为:4000~400cm-1范围内扫描32次,分辨率4cm-1,检测环境25℃,相对湿度±65%。

1.2.2.2热变性温度测定采用差示扫描量热分析仪(DSC)检测了脱细胞猪真皮基质在槲皮素处理前后的热变性温度。分别取胶原样品3~5mg,密封于DSC坩埚中,以空坩埚作参比,用氮气作样品室保护气,从10℃加热到120℃,升温速度为10℃/min[7]。

1.2.2.3热重分析分别称取质量2~5mg的QCT-pADM,于热重分析仪上进行检测,记录质量随温度的变化。检测温度范围50~800℃,升温速率20k/min,氮气保护60mL/min。1.2.2.4表面形貌观察取一定量的QCT-pADM样品,将其浸入液氮后折断,对断面和表面喷金处理,置于扫描电镜下,在加速电压20kV的条件下,放大不同倍数观察。

1.2.2.5耐酶解性能测试干燥后的QCT-pADM材料裁剪为正方形,称重(W1),将其加入含5U/mL、5mL胶原酶/PBS溶液的比色管中,在37℃的摇床中降解,隔天换降解酶液。样品在特定的时间点被取出用蒸馏水清洗5次后,冻干称量(W2)。降解速率用以下公式计算:降解速率(%)=[(W1-W2)/W2]×100%。

1.2.2.6接触角检测采用视频接触角测定仪对膜材料进行表面亲疏水性检测,将5μL煮沸冷却的蒸馏水缓慢地滴在样品表面,记录液滴与膜材料接触瞬间的图像,然后计算接触角,每个膜材料至少测定5个不同的表面区域,结果取平均值。

2结果与讨论

2.1QCT-pADM傅里叶变换红外分析红外光谱特征酰胺吸收峰可直接反映天然I型胶原特殊的三股螺旋构象。1650cm-1处为胶原的酰胺I带的吸收峰,归因于胶原分子中的C=O伸缩振动;1545cm-1处为胶原酰胺II带的吸收峰,归因于N-H的弯曲振动和C—N的伸缩振动耦合作用,胶原的酰胺I、II带与其二级结构中的α螺旋、β折叠和无规则卷曲结构直接相关[8]。1235cm-1左右处的吸收峰为酰胺III带,归因于N—H的面内弯曲振动和酰胺键内C—N拉伸,以及主链—CH2基团和侧链的甘氨酸和脯氨酸摆动振动协同产生的吸收峰[9],酰胺I带、酰胺II带和酰胺III带可直接反映胶原分子内部的有序性。在3410cm-1的酰胺A带和3082cm-1的酰胺B带两个吸收带归因于N—H基团的伸缩振动[10]。图1是QCT-pADM材料的FT-IR图。如图1所示,经不同浓度QCT改性的pADM材料的酰胺带吸收峰几乎未发生变化,说明胶原骨架的三股螺旋结构并未发生改变。

2.2差式扫描量热(DSC)分析图2为不同浓度QCT改性pADM材料的DSC图。图谱中位于20~40℃之间的小峰称为预变性峰,代表胶原分子结构出现一定程度的松弛,从螺旋结构转变为无规卷曲结构的一个预先转变状态[11]。60~85℃之间的峰则为胶原的热变性温度峰,此时胶原结构发生不可逆转的转变,其三股螺旋结构遭到破坏。由图可见,未经改性时pADM的热变性温度为65.7℃,QCT质量浓度为1、2.5、5、10、20mg/mL时,材料的热变性温度分别为73.8、75.9、78.6、81.2、83.3℃。由此可见,随着QCT浓度增加,QCT-pADM材料的热变性温度也得以提升。可能的原因是QCT结构中含有的邻苯二酚结构可与胶原的氨基、羟基等官能团发生较强的氢键结合,约束了胶原肽链之间的活动,使材料发生相转变的难度逐渐增大。因此QCT-pADM材料的热变性温度升高,湿热稳定性也随之提升。

2.3热重(TG)分析TG可用来表征材料在升温过程中的失重现象,为进一步研究QCT-pADM材料的热稳定性,对材料进行了热重分析。一般而言,在50~150℃范围内,主要发生胶原分子内氢键的断裂,由胶原纤维内的水分挥发或杂质分解引起质量损失,在200~800℃范围内,胶原三股螺旋结构与多肽链骨架被破坏[12]。图3为不同用量交联的QCT-pADM的热重曲线。由图3可见,各组样品均具有相同的失重现象。随着QCT用量增加,材料的残留质量亦呈现出增加趋势。不同QCT用量交联的QCT-pADM的热重曲线的一次微分曲线。通常认为,微分曲线的峰值为材料质量损失最快时的热分解温度。由图4可见,随着QCT用量的增加,QCT-pADM材料的微分曲线峰值均向较高温方向移动。可能的原因是QCT结构中含有的邻苯二酚结构可与胶原的氨基、羟基等官能团发生较强的氢键结合,约束了胶原肽链之间的活动,使材料发生相转变的难度逐渐增大,因此使得材料的热稳定性升高。TG分析结果与DSC热变性温度结果一致,说明QCT与pADM的交联能提高材料的结构稳定性。

2.4表面形貌观察pADM的主要成分为I型胶原。正如所知,pADM是一种由胶原分子、胶原原纤维、胶原纤维、胶原纤维束逐级构成的一种多层级胶原聚集体,纤维之间存在许多无规则的间隙。交联会在胶原分子及纤维间形成新的化学键,将胶原纤维拉紧,使得材料轻微收缩,结构变得紧实。天然pADM材料存在个体差异,无法切实确定材料交联前后的空隙变化情况。图5为不同QCT用量交联的QCT-pADM扫描电子显微镜图像。pADM内胶原纤维束层层堆叠、交织在一起,纵横交错,纤维孔隙明显。图6为经不同用量QCT交联后pADM的高倍SEM观察图。随着QCT用量增加,pADM胶原纤维间隙逐渐变小,材料变得更加紧实。可见,QCT对pADM的交联效果明显,这也是QCT-pADM材料热变性温度得以提升的一个佐证,亦可根据需要选择槲皮素用量,达到所需的交联程度。

2.5耐酶解性能测试脱细胞猪真皮基质的体外耐酶解性能较差,因此对交联后QCT-pADM材料的耐酶解稳定性检测尤为重要。pADM的主要成分为I型胶原,故选择I型胶原酶对QCT-pADM进行降解以表征其降解能力[13]。如图7所示,脱细胞猪真皮基质在1天的降解率为80%,2天后接近完全降解。经1、2.5、5、10、20mg/mLQCT溶液交联后的材料在酶液作用2天后降解率分别为20.10%、6.78%、6.77%、7.61%、7.06%;10天后降解率分别为73.71%、30.67%、25.86%、21.35%、18.23%。20天后经1mg/mLQCT溶液交联后的材料接近完全降解,经2.5、5、10、20mg/mLQCT溶液交联后的材料降解率分别为35.44%、28.75%、23.43%、20.70%。28天后,2.5mg/mLQCT溶液交联后的材料降解率接近40%,最高浓度20mg/mLQCT溶液交联后的材料降解率低于30%。由此可见,使用QCT交联pADM可大幅提高材料的耐酶降解性能,且随着QCT用量增加,pADM的耐酶解性能增强。材料抗酶解能力的提高可能得益于QCT结构中的邻苯二酚结构与pADM内胶原分子内和分子间以及微纤维间形成交联与氢键,使得材料结构更紧密,从而使其结构稳定性大幅增强,耐酶解性能大幅提高。

2.6接触角测试生物医用材料的表面亲疏水性能对其与组织和细胞之间的相互作用具有重要影响,良好的亲水性能更有利于细胞在材料表面的粘附和增殖[14]。材料表面的接触角(watercontactangle,WCA)测试可以直观反映材料的亲疏水性能,材料的WCA值以90°为界限,高于90°为疏水型材料,低于90°为亲水型材料,并且WCA值越低,材料的亲水性越好。为了表征QCT-pADM材料表面的亲疏水性能,本实验采用视频接触角测定仪检测了材料的接触角。由图8可知,未经改性的pADM材料的接触角为113.8°,亲水性较差,可能的原因是pADM是胶原聚集体,结构与胶原分子相较更封闭,暴露的亲水基团较少。而经过不同浓度QCT溶液改性后,pADM材料表面的接触角逐渐降低,且随着QCT浓度升高而降低。说明随着QCT浓度升高,材料的亲水性越来越好。分析原因,一方面可能是QCT分子中含有邻苯羟基、间苯羟基、醚键等亲水基团,pADM经QCT改性后,QCT接到了胶原纤维上,QCT分子中含有的亲水基团也引入到了pADM中,从而导致WCA降低,提高了材料表面的亲水性。另一方面,由Wenzel方程可知,当接触角小于90°时候,固体表面的粗糙因子越大,接触角就越小,表面亲水性也就越高[15-16]。

3结论

本文用不同浓度的QCT溶液(1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL)对纯pADM材料进行改性,研究了槲皮素(QCT)对脱细胞猪真皮基质(pADM)结构和性能的影响。表征结果表明QCT与pADM之间的交联作用对pADM的特征三股螺旋结构影响很小,pADM胶原纤维间隙逐渐变小,材料变得更加紧实。同时,QCT改性pADM使其热力学性能、耐酶解性能和亲水性能显著提升。可见,槲皮素可以作为脱细胞猪真皮基质的一种新的交联剂。

作者:龚居霞1,2;但卫华1,2;但年华1,2 单位:1.四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室,2.四川大学生物医学工程技术研究中心

今日养猪业杂志责任编辑:张雨    阅读:人次
农业杂志相关文章
    没有相关文章