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猪瘟E2亚单位疫苗研究

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《家畜生态学报》2017年第5期

[摘要]猪瘟是由猪瘟病毒引起的危害极大的一种传染病,具有高度的传染性和致死性,利用疫苗控制该病的流行是世界各国使用的广泛策略。E2亚单位疫苗具有安全性好、稳定性强的特点,且具有自然感染和接种疫苗的抗体差异,是未来新型疫苗研究的方向之一。本文综述了E2亚单位疫苗的保护效力、影响因素及未来发展方向。

[关键词]猪瘟;E2糖蛋白;亚单位

疫苗猪瘟(Classical swine fever,CSF),也称“烂肠瘟”,是一种由猪瘟病毒引起的传染性极强的病毒性疾病,临床上表现为急性、亚急性、慢性或温和型等形式,也可以呈现亚临床形式感染,是危害养猪业健康发展的主要传染病之一。控制CSF流行的主要策略是系统化的预防接种和非疫苗的防控措施如消毒、检疫、隔离、无害化处理等,其中疫苗的使用一直受到世界各国的广泛重视。弱毒疫苗如我国科学家研制的猪瘟兔化弱毒疫苗,对该病的控制起到了很大的积极作用。日本由于改良活疫苗的使用,在1993和2003年之间没有爆发CSF[1]。然而,单纯依赖MLV疫苗接种来消除猪瘟面临一定的困难,因为动物在自然感染和接种疫苗(MLV)产生的抗体差异即血清学DIVA是很难区分的,这就影响临床工作中的快速筛查和国际贸易。为了克服这个问题,欧盟在1999年开始大规模试验研究E2蛋白亚单位疫苗,并且成功诱导免疫猪产生抗CSF的免疫保护[2]。

1CSFV的致病机理

猪瘟最常见的感染途径是经呼吸道感染,当动物口鼻接触CSFV后,病毒在扁桃体开始复制,感染上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和内皮细胞,然后扩散到其他淋巴结。高致病性病毒可迅速分布整个身体,病毒组织中含量更高,可诱导更严重的病理变化[3]。在急性病例中,CSF可引起全身出血和免疫抑制,其作用机制是通过下调细胞因子和免疫细胞,包括内皮细胞、淋巴细胞、单核/巨噬细胞和骨髓造血干细胞(骨髓)等来实现的。猪瘟病毒可以诱导内皮细胞坏死,引起血管炎和出血,并伴有严重的贫血、血小板减少及干扰纤维蛋白原的合成,从而引起全身性出血。骨髓和B淋巴细胞、粒细胞、T淋巴细胞的减少和坏死可引起免疫抑制。猪瘟病毒通过线粒体跨膜电位和Erns蛋白直接或间接诱导的淋巴细胞凋亡。此外,猪瘟病毒可以诱导TNF-α的产生,促进B淋巴细胞的凋亡。

2E2亚单位疫苗的保护效力

E2包膜糖蛋白是猪瘟病毒的主要保护性抗原,在CSFV感染时诱导中和抗体的产生,E2蛋白已被证明是一个最有效的免疫原[4]。经过深入的研究,重组E2蛋白亚单位疫苗已经商业化,比如BAYO-VAC○R和Porcilis○R。从接种后14d到13个月,该疫苗足以提供有力的免疫保护[5-6]。然而,单剂量疫苗在免疫接种第7天不能提供保护,在第10天有部分保护作用[5]。在第21d,疫苗诱导产生中和抗体,持续6个月[6]。有报道称,在疫苗接种后14d,可以完全阻止病毒传播[7]。病毒疫苗株因基因同源或异源存在免疫效力的差异,单次疫苗接种后可以在10d、14d防止病毒水平传播并维持6个月的保护力,也有报道称疫苗接种后21d防止病毒水平传播[5-6,8]。E2亚单位疫苗可以减少垂直传播,但不能完全预防垂直传播。在疫苗首次免疫之后可以发生母婴传播,即使二免之后仍可以发生母婴传播[9]。E2亚单位疫苗接种后,存在感染和接种差异,即DIVA,这种优势有利于快速筛查受感染的猪,帮助控制和消除CSF[4]。

3影响保护效力的因素

3.1E2糖蛋白抗原结构和抗原表位研究

E2抗原结构和抗原表位具有重要意义,可以为疫苗的改进提供科学依据。研究者基于E2蛋白抗原表位的预测人工合成了多肽Pep1和Pep2,进一步的研究表明Pep1具有很好的反应原性和免疫原性[10]。科学研究表明E2糖蛋白具有四个抗原结构域即B/C/D/A,所有结构域位于E2糖蛋白N-末端的一半[11]。结构域A又被分为A1、A2和A3,E2的非保守表位位于B/C。其中,A1抗原亚区位于E2蛋白791~858位氨基酸区域。科学研究揭示了E2抗原结构模型,结构域B/C是由C693和C737之间的二硫键固定,A/D域由两个二硫键形成:一个是在C792和C856之间;另一个在C818和C828之间。在结构域B/C中,753RYLASLHKKALPT765和771LLFD774对维持构象表位的结构完整性是必不可少的[12]。

在B/C中,E713和D729决定基因型2和3型毒株的抗原特异性;D705和K761决定基因1型LPC疫苗株的抗原特异性[13]。在D/A结构域中,R845决定基因型1和3的抗原特异性[11]。具有抗原决定作用的构象表位E902,决定基因型1和2的抗原特异性,存在于C-末端区[11]。E2糖蛋白具有几个重要的线性表位抗原,比如在772LFDGTNP778中的线性表位抗原。在结构域A中,一个高度保守的中和线性表位抗原829TAVSPTTLR837通过使用单克隆抗体(mAb)WH303进行了鉴定,已被用于基于表位的疫苗开发[14-17]。该单克隆抗体WH303已使用广泛的免疫组化标记,但WH303具有MLV病毒标志抗原,因此不能用于DIVA,不能进行快速筛查。在E2C端区域,研究发现具有一个病毒线性表位995yyep998之间高度保守的结构[11]。亚单位疫苗表现为非复制单抗原,以单体或二聚物的形式存在,不是锚钉在病毒包膜。像其他蛋白质一样,注射E2抗原的量在接种后将随时间而发生衰减,所以在临床实践中,都需要二次疫苗接种。

3.2母源抗体的影响

研究发现,3周龄的仔猪母源抗体含量最高;在5或7周龄第一剂量亚单位疫苗,4周后加强亚单位疫苗免疫接种的仔猪具有很高的中和抗体[18]。在2周龄(即仍具有母源抗体时)接种疫苗,机体产生的抗体效价显著低于3、6个月后仔猪抗体的滴度[19]。

3.3抗原性差异的影响

两种商业化的猪瘟病毒E2亚单位疫苗来源于布雷西亚毒株基因型1.2和AlfortTübingen基因型1.1。但是,有研究表明,在大多数欧洲和亚洲国家,自然分离获得的CSFVs已经从原来的基因型1或3变异成基因型2[20]。在我国,疫苗病毒的基因型与目前流行的病毒基因型也存在一定的差异[21]。猪瘟病毒的基因型特异性血清,与外源E2蛋白结合的有效性比同源的E2蛋白低,表明在CSFVs中E2的差异对交叉中和作用至关重要[22-23]。基因序列的改变可能导致E2糖蛋白结构的变化,因此弄清楚亚单位疫苗和猪瘟流行病毒株之间的交叉保护问题至关重要。然而,目前生产的两个商业化CS-FVE2亚单位疫苗(基因型1.1和1.2)对异源菌株如帕德博恩(Paderborn)基因型2.1不能提供完全保护。不同基因型的病毒的抗原性变异可以通过交叉中和试验进行评价,同源毒株之间的NT抗体显著高于异源毒株。

总之,这些研究表明,不同基因型的毒株之间间存在抗原差异,从而影响免疫保护效果。活病毒或重组E2蛋白可以诱导机体产生抗体,这种抗体中对基因同源毒株的作用优于对异源毒株的作用,由活病毒引起的抗体滴度比重组蛋白高。血清交叉中和显示基因同源株比异源株高,这种差异与单克隆抗体的氨基酸差异有关。猪瘟病毒不同基因型间的抗原变异通过猪瘟病毒特异性单克隆抗体的不同反应模式被证实[22-23]。E2特异单克隆抗体对同源菌株具有很好的结合和中和作用[22-23]。研究表明,B/C结构域中H710,H724,N725,D729,K734,M738的单点突变和D/A结构域中T823,P833,T834,R837的单点突变可以导致中和单克隆抗体结合性质的丧失。在710位置的氨基酸残基可以影响单克隆抗体的结合和中和[24]。在B/C结构域的D705,E713,D729和K761残基、在A结构域的R845残基,以及在C-末端区域的E902残基是基因型1,2或3的抗原特异性的关键因素[11,13]。最近研究表明,基因型2的E2蛋白抗原区变异可以影响血清反应性,其中E37N和V45Q两个位点置换具有显著影响,其可能与E2蛋白的构象变化密切相关[25]。

4小结

4.1E2亚单位疫苗的优势

E2亚单位疫苗仅含病毒的保护性抗原,不含病毒的其他组成成分,不包含遗传信息,因此与活疫苗相比具有安全性好、稳定性强的特点,在生产工艺上无需进行灭活处理。在临床应用时存在一个很大的优势,接种后具有感染和接种的差异性,即DIVA,是典型的DIVA疫苗,从而有利于临床实践中的快速筛查。Erns和NS3ELISAs可以用于检测E2亚单位疫苗,chekit○R比priocheck○R猪瘟病毒的敏感性较高[4]。4.2面临的挑战E2亚单位疫苗保护效果差,低于MLV,研究表明,中国株疫苗比E2疫苗能提前1~2周建立有效的群体免疫。除此之外,E2亚单位疫苗不能完全预防垂直传播,有报道称,在疫苗首次免疫之后可以发生母婴传播,即使二免之后仍可以发生母婴传播[9]。在免疫反应方面,E2亚单位疫苗只能诱导抗体反应,免疫原性比较低,通常需要采用相应的方法如佐剂或载体等。而且E2亚单位疫苗的生产成本比常规疫苗高,这也给该疫苗大规模的商业化生产和推广应用带来一个难题。另外,猪瘟病毒变异毒株的产生是猪瘟控制面临的难题之一,E2亚单位疫苗如何应对猪瘟病毒基因型变异也是不得不面临的一个挑战。

4.3未来发展趋势

疫苗的开发要求克服各种影响,提高免疫保护效力。在一般情况下,E2亚单位疫苗只能诱导抗体反应,那么提高疫苗T细胞免疫反应可能成为未来疫苗开发的努力方向之一,在亚单位疫苗诱导有效的细胞免疫反应将会引起越来越多研究者的兴趣。蛋白质组学方法为亚单位疫苗和佐剂研究提供了新的机会,可在将来与结构生物学方法相联合来提高T细胞反应的预测[26]。最近研究表明,杆状病毒可以诱导兔E2糖蛋白的表达产生保护性免疫反应,证实了CSFV-1.1E2和CSFV-1.1+2.1E2不仅引起体液和细胞介导的免疫反应,而且在兔体中提供了对CSFVC株的完全保护[27]。除此之外,通过重组可以提高酵母猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的表达[28]。国内研究者进行了E2基因工程亚单位疫苗的研究,通过两次免疫小鼠产生了特异性抗体,其滴度可达1∶1500[29]。通过基因工程技术实现了猪瘟病毒E2蛋白在大肠杆菌中的表达[30]。有研究表明,母猪免疫基因工程E2亚单位疫苗具有低的病毒载量和高的中和抗体滴度[31]。E2和E0联合使用具有协同作用,该发现为新型亚单位疫苗候选抗原的研究提供了参考[32]。人类医学对亚单位疫苗的研究如登革热重组亚单位疫苗的研究等也可以为E2亚单位疫苗的研究提供借鉴思路[33]。利用基因重组技术生产E2亚单位疫苗将受到越来越多的关注,重组E2的设计应包括中和保守的构象和线性表位,考虑抗原特异性残基的变化,保持抗原免疫原性。除此之外,增强免疫效力,降低生产成本,以及临床实际应用方面都可能成为未来的研究热点。

作者:吕永智 单位:重庆三峡职业学院

家畜生态学报责任编辑:张雨    阅读:人次
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