水稻类病斑突变系的培育范文

《核农学报》2016年第六期

摘要:

利用γ射线辐照水稻品种嘉浙B的种子，从处理后代中获得了稳定的类病斑突变体嘉浙DB。为了阐明该突变体性状形成的遗传和生物学基础，开展了突变基因定位和类病斑特征及叶绿体相关特性的研究。结果表明，嘉浙DB是一种典型的Sekiguchi类病斑突变体，在无病原菌侵染和外界胁迫的情况下，叶片上可自发形成棕黄色病斑，病斑的面积随着植株的生长不断扩大;在病斑扩展阶段，突变体叶片细胞中叶绿体结构紊乱，提早降解，光合作用效率显著下降;嘉浙DB的类病斑性状属隐性性状，很可能受LOC_Os12g16720的1个突变等位基因控制，其第1425位核苷酸G缺失可导致移码突变从而编码一个截断的蛋白;突变体中清除活性氧的4个叶绿体抗坏血酸过氧化物酶(APX)的基因转录水平在白天光合作用下均显著高于野生型，而在夜间则无显著差异。叶绿体的结构紊乱及细胞内的高活性氧含量可能是引发突变体叶片细胞凋亡的原因。本研究为从叶绿体的角度阐述Sekiguchi类病斑发生的分子机制提供了依据。

关键词:

类病斑突变体;Sekiguchi;叶绿体;抗坏血酸过氧化物酶;细胞凋亡

在无病原菌侵染和逆境或损伤侵害时，植物叶片自发形成的与被病原菌侵染类似的坏死症状统称为类病斑，根据病斑出现时间和是否扩散，LM可分为起始型和扩散型2类［1］。前者在叶片伸出叶鞘时就已带有病斑，一般较小，多呈点状;后者在叶片伸出叶鞘后才出现，斑点面积不断扩大，多为不规则形状，最后斑点间可扩展互连而使整张叶片枯死。目前，通过诱发突变已获得了多种突变体，培育了大批优良品种，在植物功能基因组学研究中发挥了重要作用［2－4］。LM突变是水稻中常见的一类突变体，斑点形状各异［5－7］。其中，Segikuchi突变体是水稻中最早被发现的一类LM突变体，属于扩散型LM，可自发形成，且在接种稻瘟病病原菌或者化学试剂(过氧化氢)处理之后会提前出现［8－9］。同时SekiguchiLM是一种光依赖型类病斑，其形成需要光照诱导［10］。已克隆的水稻LM突变基因编码不同功能的蛋白，如泛素介导蛋白降解相关蛋白［11］、网格蛋白受体［12］、RNA结合蛋白［13］、RNA选择性剪接蛋白［14］。Fujiwara等［15］克隆得到控制Sekiguchi病斑的基因，该基因编码细胞色素P450单加氧酶，可催化色胺转化为五羟色胺。本研究在γ射线辐射诱变的群体中发现了1株类病斑突变体，经多代繁殖形成了稳定的LM突变系。之后将突变基因定位在1个包含Sekiguchi类病斑突变基因的区段，确认基因CYP71A1出现了G缺失突变。在此基础上，对其叶绿体结构、光合作用特性和活性氧清除相关基因表达等开展研究，分析突变体中叶绿体降解的特征及其在细胞凋亡过程中的作用，旨在为进一步阐明类病斑发生的分子机制提供依据。

1材料与方法

1.1LM突变体培育采用350Gy60Co－γ射线诱变处理干种子建立籼稻品种嘉浙B的突变群体。γ射线辐照在浙江大学辐照中心完成，M1种植方法同李瑞清等［16］的报道。在成熟期的M2群体中(约20000株)发现了1株叶片出现不规则斑点的变异株。之后在M3和M4群体中继续观察到相同的类病斑性状，群体内不再分离，从而将其定名为嘉浙B大斑突变体，简称嘉浙DB。在分蘖期，分别取嘉浙DB具大斑表型的叶片，与野生型叶片一起进行胎盘蓝染色。具体方法为:将叶片浸泡于染液中(30mL乙醇，10g苯酚，10mg胎盘蓝，10mL乳酸，10mL甘油，10mL水)，煮沸2～3min，室温放置2h。然后用2.5mg•mL－1水合氯醛脱色，并保存于50%甘油中。

1.2基因定位为定位大斑突变基因，用嘉浙DB与5个水稻品种(日本晴、浙粳122、嘉911、嘉33和协青早)杂交，F1自交得到F2群体。在分蘖期，选取携带大斑的单株采用CTAB法［16］从叶片中提取基因组DNA。参照Gramene网站相关信息选择用于定位的微卫星标记;同时用洪隽等［17］的方法在定位区段内设计插入/缺失标记(InDel)，用于突变基因定位(表1)。采用20μLPCR反应体系:2μL基因组DNA(约50ng)、上下游引物(10μmol•L－1)各0.5μL，2×TaqMix10μL，用ddH2O补足20μL。PCR程序设置为:94℃预变性90s;94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环;最后72℃延伸5min。PCR产物在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，银染法显示DNA条带［18］。

1.3叶片显微结构观察和光合作用的测量从已经出现LM的嘉浙DB植株中，选取3个不同发展阶段的叶片进行叶绿体显微结构的观察，即尚未出现类病斑的叶片(L1)，出现病斑叶片中的非病斑区域(L2)和病斑区域(L3)。所取叶片在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，之后用0.1M磷酸缓冲液(pH值7.0)漂洗3次，每次15min，再用1%锇酸处理1～2h，磷酸缓冲液清洗后依次用乙醇(50%、70%、80%、90%、95%、100%)梯度脱水，每次15min，最后用纯丙酮处理20min。用树脂包埋剂/丙酮(1∶1和3∶1)分别渗透处理1h和3h后，在纯包埋剂中渗透过夜。样品切成70～90nm薄片，用柠檬酸铅和醋酸双氧铀各染色15min，在透射显微镜(HitachiH－7650，日本日立)下观察超微结构。在下午13点到14点间(光照强度约1000μmolE•m－2•s－1)用光合速率测定仪Yaxin－1101(北京雅欣理仪科技有限公司)测定嘉浙DB的3类病斑不同发展阶段的叶片及对照嘉浙B的净光合速率，蒸腾速率、气孔导度、细胞间CO2浓度。

1.4RNA的提取及实时定量PCR在分蘖期，取嘉浙B和嘉浙DB无斑点叶片组织，采用TRIzol试剂提取总RNA。经DNe酶处理后，取500ngRNA用反转录试剂盒M-MLV(大连TaKaRa公司)反转录成cDNA。采用实时荧光定量PCR对4个叶绿体抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因转录本丰度进行分析［19］。PCR体系为10μL，含1μLcDNA、0.4μL上下游引物(10μmol•L－1)、5μL2×Mix缓冲液(Mtermix，TOYOBO)，双蒸水补足10μL。PCR程序为:94℃充分变性2min;94℃变性30s，60℃复性/延伸1min，40个循环。以管家基因Actin2(LOC_Os19g36650)作为内参基因(表2)，采取2－ΔΔCt方法分析相对表达量［20］。

1.5数据分析利用软件StatView对光合作用及RT-PCR数据进行方差(ANOVA)分析，检测差异显著性。

2结果与分析

2.1类病斑突变体嘉浙DB的主要特征在幼苗阶段(约萌发后6周内)，嘉浙DB叶片与野生型嘉浙B表现一致，未出现明显的类病斑。但从分蘖期开始，嘉浙DB完全伸展叶后出现类病斑，随后病斑扩大逐步形成不规则的形状(图1－A左)。斑点从小到大，至15d时大小已达0.8×1.5cm左右。最后，类病斑相互连在一起直至覆盖整个叶片，类似枯叶，肉眼可见其大小的变化进程(图1－B)，长度可达约1.5cm，宽度约0.9cm。通过胎盘蓝染色，斑点区域被染上深重的颜色，染色区域的大小和形状与叶片上的病斑区域一致，说明斑点区域的细胞已经死亡(图1－A右)。由于病斑总是在叶片完全伸出后才形成，植株可以正常生殖生长，在植株衰老死亡之前，一定数量的种子已经成熟，因此不影响突变体的传代。

2.2类病斑基因定位与分析在嘉浙B和嘉浙DB的杂交F2群体中，叶片出现类病斑与叶片正常植株分别是48株和152株，符合1∶3的分离比(χ2=0.16)，表明嘉浙DB的LM性状由单隐性基因控制。为了克隆此突变基因，用F2群体中鉴定出来的1685个突变型单株进行基因定位。首先利用微卫星标记将突变基因定位在第12号染色体上，介于RM101和RM1795之间;在这2个位点上分别有7个和6个单株表现为杂合型(图2－A)。在此基础上，进一步利用InDel标记缩小范围，将其限定在标记ID22和ID18间约300kb区段内(图2－B)。根据Gramene网站信息，在这一区域内共有58个基因。除LOC_Os12g16720外，有38个基因注释为转座子或者反转座子基因，其它19个编码蛋白的基因中，有9个功能未知的蛋白，其余10个基因编码功能蛋白(表3)。其中，LOC_Os12g16720编码细胞色素P450蛋白CYP71A1，该基因的突变已被确认为导致了Sekiguchi突变表型［12］。最后将该基因和其它3个候选基因(LOC_Os12g16650，LOC_Os12g16690，LOC_Os12g17090)的全长进行测序。结果表明，嘉浙B和嘉浙DB只在基因LOC_Os12g16720存在差异，突变体的第1425位核苷酸G缺失，理论上将造成移码突变，而其它3个基因的序列完全一致(图2－C)。进一步分析发现，细胞色素P450蛋白存在一个与卟啉环结合的结构域核心保守序列FGGGRRGCPG，而1425G缺失引起的移码突变恰能使这一结构域丢失，从而使蛋白失去功能(图2－D)。

2.3大斑突变对叶绿体结构和光合作用的影响用透射电镜对突变体叶片的3种组织(L1、L2、L3)进行观察，以探究嘉浙DB中叶绿体超微结构的变化。结果表明，野生型植株嘉浙B叶片组织中可见完整的、平行排列的基粒类囊体，基粒之间的基质类囊体也清晰可见(图3－A、E)，而嘉浙DB叶片组织中，L1基粒已经开始降解，呈圆形，有嗜锇颗粒出现，表明类囊体片层开始降解(图3－B、F)。L2基粒的整齐平行排列性消失，轮廓模糊(图3－C、G)，同时出现了溶酶体和一些囊泡小球。L3细胞已处于混乱状态，无明显的细胞器，细胞结构区室化消失，即整个细胞完全降解，只剩下细胞壁(图3－D、G)。为了进一步分析叶绿体的破坏是否会对光合作用造成影响，分别测定了嘉浙B和嘉浙DB叶片的4个光合作用相关参数:净光合速率(Pn)，蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、细胞间CO2浓度(Ci)。由图4可知，与嘉浙B相比，嘉浙DB的叶片组织Pn、Tr和Gs都显著下降，表明类病斑突变对叶片光合作用具有显著的负效应。此外，突变体的Ci显著高于野生型亲本，表明CO2在突变体组织中不能被有效同化。在突变体中，L2的光合作用均低于L1，但差异不显著，表明两者的内部结构发生变化，具有渐进性。2.4清除活性氧相关基因的表达为了探明嘉浙DB中叶绿体提早降解是否与活性氧过量有关，通过实时荧光定量PCR分析了4个叶绿体抗坏血酸过氧化物酶APX基因的表达水平。与嘉浙B相比，嘉浙DB的APX基因的转录水平在白天显著提高，而在夜间两者无差异(图5)。

3讨论

类病斑是一类常见的突变性状，由于其在植物细胞程序性死亡、超敏反应等在生物学研究中具有独特的利用价值，该类材料的鉴定和研究一直受到高度重视［21－23］。Fujiawara等［15］曾用EMS诱变获得3个表型与嘉浙DB相似的类病斑突变体，发现其分别由LOC_Os12g16720基因的3个突变［G1009A(发生在内含子区域，影响基因表达)，C1037T(Thr314Ile)和G1556A(Gly455p)］造成。本研究通过γ射线诱变处理育成了一个Sekiguchi类病斑突变体，基因定位和候选基因分析结果表明，该突变性状有可能为CYP71A1基因突变所致。由于嘉浙DB突变可使蛋白的保守结构域消失，因此是一份研究CYP71A1及其生物学功能的新的突变体材料。一般认为，线粒体在PCD中发挥着重要的作用，可以因为膜电位的变化、细胞色素c的释放等原因引发细胞质凋亡酶等下游一系列反应，从而促进PCD的发生［24－25］。在叶绿体光合作用过程中也可以产生大量活性氧(ROS)，它们如果在叶绿体中不能被有效分解，将会破坏脂类物质和蛋白质，造成细胞衰老甚至引起细胞的死亡［26－28］。与呼吸作用电子传递链一样，在叶绿体中也存在光合电子传递链，存在着细胞色素f，因此也可能介导植物发生PCD［29－30］。已经明确一些类病斑突变体由于叶绿素代谢上存在缺陷可以引起胞凋亡，例如ACD1/ACD2，分别编码脱镁叶绿素酸氧化酶和叶红素还原酶，它们的突变导致叶绿素代谢障碍，从而引起细胞凋亡调节系统的紊乱［31－32］。虽然已知Sekiguchi类突变体也表现为典型的PCD症状，但对引起的原因迄今尚不十分清楚。在本研究中，4个APX基因的转录水平在白天显著高于嘉浙B，表明突变体中的ROS含量很高，因此有可能会促使PCD的发生。此外，从叶绿体的电镜照片可以看出，突变体的叶绿体结构出现了损坏，发现了溶酶体和一些囊泡小球，这些囊泡小球有可能用于运输叶绿体分解物质，尤其是核酮糖羧化酶，而它们也是细胞死亡的一个重要标志［33－34］。通过亚细胞定位，已经明确CYP71A1是一个内质网蛋白［12］，从而排除了由于其缺失直接引起叶绿体结构紊乱的可能性。因此，叶绿体结构的损坏更有可能是ROS不能及时清除造成的。此外，尽管突变体植株L1组织部位和野生型叶片都表现为绿色无病斑，但前者的光合速率显著低于后者，说明其叶绿体结构受到损伤，从而影响光合作用。

4结论

本研究获得了一份Sekiguchi类病斑突变体嘉浙DB，由编码细胞色素氧化酶CYP71A1的基因LOC_Os12g16720发生缺失突变引起。该突变体叶绿体结构紊乱，叶绿体提前分解，光合作用下降。编码APX酶的基因转录水平显著提高，表明突变体无法及时清除叶绿体产生的大量活性氧，从而造成PCD的发生。

作者：芦海平 张华丽 富昊伟 李友发 崔海瑞 舒庆尧 单位：浙江大学原子核农业科学研究所/农业部核农学重点开放实验室 嘉兴市农业科学研究院 浙江大学作物科学研究所