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药用吉祥草的研究进程

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吉祥草是百合科植物中单种属植物,又名观音草、小叶万年青,分布在我国华东、中南、西南各省区。吉祥草作为草药在我国苗族地区应用广泛。民间一般采用传统煎药法,制作成吉祥草煎剂,供患者服用[1]。吉祥草全草主要含甾体、黄酮、木脂素、萜类、有机酸等多种化学成分,现代研究表明吉祥草还具有降血糖、抑制磷酸二酯酶以及杀灭钉螺等药理活性。为了全面了解吉祥草的研究进展,笔者对吉祥草的化学成分、提取方法和药理作用等方面进行系统的综述,为开发利用具有药用价值的吉祥草先导化合物提供科学依据。

1吉祥草化学成分研究

我国学者针对吉祥草的不同部位开展化学成分研究,分离得到系列新的化合物,为开展药理作用研究奠定了坚实的物质基础。各团队就所在地区的吉祥草在7月采摘,然后自然晾干后粉碎全草或利用根茎等部位进行有效成分分离提取,分离得到许多新的化合物。王玉婷、ZHENG、王倩等[2-4]对湖北省长阳地区的吉祥草进行系统的先导化合物的分离及化学成分研究。从吉祥草空干粉末状根茎和新鲜根茎部位乙醇提取物发现了许多甾体化合物和黄酮类,其中2个甾体和2个苯丙类化合物:(25s)-22,3-dihdroxoy-5β-furost-3β(1),26-diol-26-O-β-D-glucopyranosid(2),26-O-β-D-glucopyranosylfurostane-3β,26-diol-3-O-β-D-gluco-pyranoside(3),1-O-(6-O-α-L-rhamnopyranosyl-β-D-glucopyranosyl-2-hydroxy-4-allybenzene,Lariciresinol-9-O-β-D-glucopyranoside(4)为新化合物。陈苓丽等[5]对贵州产吉祥草全草通过水提、减压浓缩,然后利用30%,60%和90%乙醇洗脱等工序进行分离及化学成分研究,分离得到8个化合物,分别是:diosphenol(1)、N-benzoyl-L-phenylalaninol(2)、大豆素(3)、3‘-羟基大豆苷元(4)、bis(2-ethylhexyl)phthalate(5)、邻苯二酸二正丁酯(6)、丁香脂素(7)、刺五加酮(8),化合物1为新的天然产物,化合物2—8为首次从该属植物中分离得到。WANG等[6]在2012年对空干粉末全草利用水回流3h进行分离提取,得到2个新的螺旋甾烷醇异构体皂苷(25R)-5b-spirostane-(1a,3a)-diol(1)和(25R)-5b-spirostane-(1a,2a,3a,4a)-tetrol(2)。HU等[7]对云南产干燥吉祥草70%醇提取物进行化学成分分析,得到5个化合物,分别为26-O-β-D-glucopyranosyl-(25S)-5β-furost-20(22)-en-1α,3β,26-triol-1-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl]-3-O-α-L-rhamnopyranoside(1),(1β,3β,16β,22S)-cholest-5-en-1,3,16,22-tetrol-1,16-di-(β-D-glucopyranoside)(2),diosgenin(3),β-sitosterol(4),ecdysterone(5),其中化合物1为一种新的呋甾皂苷化合物。张东东等[8]对陕西省吉祥草进行醇提取,后经石油醚正丁醇提取,得到水饱和正丁醇提取部位,分离鉴定9个甾体类化合物,分别为薯蓣皂苷元(1)、奇梯皂苷元(2)、潘托落皂苷元(3)、β-豆甾醇(4)、β-豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)、kitigenin5-O-β-D-glucopyrannoside(6)、pentologenin5-O-β-D-glucopyrannoside(7)、薯蓣皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(8)、25(S)-5β-1β-3β-diol(9),其中化合物8和9为首次从该属植物中分离得到。SONG、ZHANG等[9-10]对吉祥草空干后整草部位进行80%乙醇提取物分析,又发现3个甾体皂苷化合物26-O-β-d-glucopyranosyl-(25S)-20-O-methyl-5β-furost-22(23)-en-1β,3β,20α,26-tetraol1-O-β-d-fucopyranosyl-(1→2)-[α-l-rhamnopyranosyl]-3-O-α-l-rhamnopyranoside(1),26-O-β-d-gluco-pyranosyl-(25S)-20-O-methyl-5β-furost-22(23)-en-1β,3β,20α,26-tetraol1-O-β-d-xylopyranosyl-(1→2)-[α-l-rhamnopyranosyl]-3-O-α-l-rhamnopyranoside(2),(25S)-5β-spirostan-1β,3β-diol1-O-β-d-fucopyranosyl-(1→2)-[α-l-rhamnopyranosyl]-3-O-α-l-rhamno-pyranoside(3)。

2有效成分提取及测定方法研究

2.1提取工艺研究罗夫来等[11]用响应面法研究吉祥草提取工艺。结果表明,对吉祥草的料液比为20.39∶1(g/mL),81.24℃条件下,水浴回流提取2次,每次79.76min进行提取,吉祥草皂苷得率为1.36%。吉祥草药材皂苷含量在2.743~13.825mg•g-1,平均为1.657mg•g-1。丁丽娜等[12]采用正交实验法研究吉祥草的水提醇沉工艺,得出总皂苷的水提醇沉工艺为10倍量水提取,浓缩比相当于生药0.5g•mL-1,醇沉浓度50%,效果最好。

2.2测定方法研究及标准建立刘丽娜等[13]建立HPLC-ELSD法测定吉祥草中皂苷A含量的方法。该方法简便、快速、准确、灵敏度高,可用于吉祥草中皂苷A含量测定,具体条件是采用AglientEclipse-XDB-C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm),甲醇-水(46∶54)为流动相,流速1.0mL•min-1,雾化空气压力0.30MPa,ELSD漂移管温度40℃,柱温40℃。结果表明,皂苷A进样量在0.618~9.888μg呈良好线性关系(r=0.9998),平均回收率为99.11%,RSD=2.47%。田源红等[14]对吉祥草中阿魏酸和芦丁建立HPLC测定方法。结果表明:阿魏酸在0.40~2.40μg范围内呈良好线性关系(r=0.9999),平均回收率为100.1%,RSD为2.8%;芦丁在0.625~5.625μg范围内呈良好线性关系(r=0.9999),平均回收率为100.7%,RSD为1.3%。金兆磊等[15]利用HPLC-ELSD法进一步建立不同产地吉祥草药材吉祥草的指纹图谱,共找到共有峰6个,该方法具有良好的重复性和稳定性,为有效控制吉祥草药材的质量和评价其质量品质提供理论依据。安斯扬等[16]对多产地吉祥草药材中水分、总灰分、酸不溶性灰分、农药残留、重金属、浸出物及总皂苷含量进行定量测定,进一步完善吉祥草药材质量标准提供了依据。HOU等[17]提出细胞膜色谱(cellmembranechromatography,CMC),用于吉祥草的药理分析,可以揭示药物和受体相互作用,用于活性物质的筛选,具有较好的应用前景。

3药理活性

3.1抗肿瘤活性与作用机制研究刘海等[18]探讨吉祥草及其果实的乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对肿瘤细胞的体外抑制作用,筛选抗肿瘤活性部位。分别以人肾透明细胞腺癌786-O细胞、人结肠癌HT-29细胞及人肺腺癌A549细胞为供试细胞,采用噻唑蓝(MTT)比色法对吉祥草及其果实不同提取部位进行体外抗肿瘤活性筛选。结果表明:吉祥草乙醇提取部位、正丁醇分离部位及其果实乙酸乙酯分离部位、正丁醇分离部位对肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用,其中吉祥草正丁醇分离部位对786-O、HT-29、A549的细胞毒性较强,其半数抑制浓度(IC50)分别为92.78,96.04,63.24mg•L-1,果实正丁醇分离部位对786-O、HT-29、A549细胞有一定的增殖抑制作用,其IC50分别为179.03,189.67,329.95mg•L-1。研究表明吉祥草正丁醇分离部位是吉祥草主要的抗肿瘤活性部位。杨小姣等[19]研究吉祥草中甾体皂苷RCE-4对宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用。将Caski(4×107•mL-1)细胞悬液0.3mL接种于裸鼠右侧后腿背部皮下,建立宫颈癌移植瘤模型,然后按瘤体积大小随机分为模型组、紫杉醇(10mg•kg-1)和RCE-4(25,50,100mg•kg-1)组,每天1次给药,连续4周。末次给药次日处死裸鼠,称定裸鼠体质量、瘤质量,测量肿瘤体积,通过计算抑瘤率,在光镜下观察移植瘤组织形态学变化,TUNEL染色测定细胞凋亡率,免疫组化检测肿瘤组织中环氧化酶2(COX-2)表达,荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定移植瘤组织中B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bax、Caspase-3和Caspase-9mRNA表达,计算Bcl-2/Bax值,Westernblotting检测移植瘤组织中Survivin蛋白表达。发现RCE-4(25,50,100mg•kg-1)可明显降低宫颈癌裸鼠移植瘤的体积和瘤质量(P<0.05或P<0.01),上调Bax、Caspase-3和Caspase-9mRNA表达,下调Bcl-2mRNA表达和COX-2、Survivin蛋白表达及Bcl-2/Bax值(P<0.05或P<0.01)。研究结果表明:RCE-4对宫颈癌裸鼠移植瘤的生长具有显著抑制作用,其机制可能与其上调Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达和下调Survivin、Bcl-2、COX-2的表达有关。杨小姣等[20]进一步探讨吉祥草中甾体皂苷RCE-4激活p53-ROS通路诱导人肝癌HepG2细胞的表现,深入研究了吉祥草中RCE-4对HepG2的抑制作用及分子机制。主要采用不同浓度的RCE-4处理HepG2细胞不同时间后,通过MTT法检测不同浓度RCE-4对HepG2细胞增殖的影响,并用DCFH-DA荧光探针标记进行细胞内的活性氧水平检测,Hoechst33258染色观察细胞形态变化,AnnexinV-FITC/PI染色测定细胞凋亡率,PI标记测定细胞周期,JC-1染色法测定细胞线粒体跨膜电位水平,Caspase试剂盒检测HepG2细胞中Caspase-9和Caspase-3的活性,Westernblotting检测Bcl-2、Bax和p53蛋白表达,并计算Bcl-2与Bax的比值。研究结果表明:RCE-4在16.2~50.0μmol•L-1浓度范围内对HepG2细胞的生长抑制作用呈明显的时间-剂量依赖性,当药物浓度达到12.5μmol•L-1时,抑制率最大达到54.2%,并且经分析软件进行计算其IC50值为12.03μmol•L-1;RCE-4(6.25,12.5和25.0μmol•L-1)处理HepG2细胞12,24和48h均能显著抑制HepG2细胞增殖,促进其凋亡(P<0.05或P<0.01);当药物浓度为25.0μmol•L-1,作用时间24h时,其抑制率高达93.4%。RCE-4(6.25,1.25和25.0μmol•L-1)处理HepG2细胞24h后可显著增加HepG2细胞内活性氧(ROS)水平,抑制细胞凋亡,阻滞细胞周期于G2/M期,降低线粒体膜电位,上调Bax和p53蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达和Bcl-2与Bax的比值,增强Caspase-9和Caspase-3的活性(P<0.05或P<0.01)。研究表明RCE-4可显著抑制HepG2细胞增殖和诱导凋亡,其作用机制可能与其增加细胞内ROS水平,促进p53及下游靶基因Bax表达,增强Caspase-9和Caspase-3活性,抑制Bcl-2表达,降低Bcl-2和Bax比值及线粒体膜电位,阻滞细胞于G2/M期有关。

3.2抗氧化活性曾文等[21]还对吉祥草中5种提取物对神经细胞的抗氧化作用功效进行研究。建立过氧化氢(H2O2)所致人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞系氧化应激损伤模型,应用MTT法探讨RC-1、RC-2、RC-3、RC-4和RC-5的细胞毒性及抗氧化保护作用。结果表明,RC-1、RC-2、RC-3、RC-4均表现出一定的抗氧化活性,在10μg•mL-1时,RC-2、RC-3和RC-4分别比模型对照组存活率高42.8%,42.9%和47.9%。结果表明吉祥草及其提取物可以作为一种潜在的抗神经退行性疾病药物进行开发和利用。王慧等[22]对吉祥草中总黄酮的体外抗氧化活性进行研究,采用盐酸-镁粉法测定黄酮含量,通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)法和铁离子还原(ferricionantioxidantpower,FRAP)法评价吉祥草总黄酮提取物的抗氧化活性。结果表明,吉祥草中总黄酮具有较强的抗氧化活性,总黄酮提取物和脂溶性成分的半数有效浓度(EC50)为(0.253±0.009)g•L-1,FRAP值为(0.964±0.028)mmol•g-1。

3.3抗炎活性金兆磊等[23]研究吉祥草药材抗炎、止咳作用及谱效关系,分别采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法、小鼠氨水引咳法,观察吉祥草药材不同提取部位抗炎、止咳作用。结果表明,吉祥草药材食用乙醇提取物3个剂量给药组抗炎作用非常显著(P<0.05),大、小剂量组明显延长咳嗽时间(P<0.05),大剂量组明显减少咳嗽次数(P<0.05);水提物3个剂量组同样具有明显抗炎作用(P<0.05),水提物大剂量组咳嗽次数明显增多(P<0.05),咳嗽时间缩短(P<0.05);石油醚提取物各剂量组抗炎及止咳作用不显著。HAN等[24]对吉祥草中60%~90%醇提取物进行化痰和镇咳效果评价,在0.372g•kg-1剂量可有效降低咳嗽次数。可见,吉祥草药材食用乙醇提取物及水提物具有较好的抗炎、止咳活性。付雪娇等[25]针对吉祥草乙酸乙酯提取物及该部位分离得到的化合物RCE-4的抗炎活性及机制,采用细菌脂多糖(LPS)刺激经佛波酯(PMA)诱导的人单核细胞THP-1体外炎症模型检测其干预前后上清液中促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的分泌量,角叉菜胶致小鼠足趾肿胀模型检测其肿胀抑制率,通过佐剂关节炎模型检测组织内和血清中一氧化氮(NO)的含量。结果表明,化合物RCE-4能显著减少促炎因子的分泌量(P<0.01),抑制角叉菜胶致小鼠足趾肿胀作用(P<0.05),减少佐剂性关节炎模型组织内和血清中NO的含量(P<0.01),并且抑制作用具有时间和剂量依赖性。表明吉祥草乙酸乙酯提取物及RCE-4具有明显的抗炎活性,其作用机制可能与抑制促炎细胞因子和NO的释放有关。

4展望

通过对该药材的化学成分、指纹图谱、药理等系统研究发现,吉祥草在抗炎、抗肿瘤方面具有巨大的应用前景。目前对其作用机制和药动学方面的研究还有待进一步加强,为新药发现和成药研究奠定更加科学的基础。

作者:邢翔飞1,金桂兰1,奚炜1,陈剑锋1,2,程凡1,2,邹坤1,2,龚大春1,2 单位:1.三峡大学人民医院药物制剂研究所,2.三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室

草原与草业杂志责任编辑:张雨    阅读:人次