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KHV检验方式及应对举措
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作者:孟庆峰 钱爱东 王伟利 单位:吉林农业大学 动物科技学院 吉林出入境检验检疫局

病原分离鉴定

锦鲤疱疹病毒的分离主要采用细胞培养分离技术,此技术是最准确的诊断方法,国际兽疫局(OIE)将其推荐为首选方法。研究表明,锦鲤疱疹病毒具有种属特异性,只能在原始宿主细胞上生长,即只能在锦鲤鳍细胞(KF)上生长,并产生特征性病变,锦鲤疱疹病毒的这种特性,可作为一种诊断方法。锦鲤鳍细胞系是美国的研究人员在1997年建立起来的,锦鲤疱疹病毒在锦鲤鳍细胞上的适宜培养温度为15~25℃,最适培养温度为20℃。

P.R.Calle等研究表明,常用的鱼细胞都很难分离到病毒,锦鲤疱疹病毒只能在锦鲤鳍细胞、宿主细胞及鱼脑中增殖,再通过细胞培养的方法对临床受感染鱼体进行病毒分离。刘荭等人的研究也证实,该病毒不可能在草鱼性腺细胞系(CO)、鲤鱼上皮细胞(EPC)和鲤鱼肾(CK)细胞上生长。朱霞等将鲤鱼肾细胞和单层框镜鲤鱼鳍条细胞共同培养,培养5~6d后出现典型的细胞病变,这是国内首次分离到的锦鲤疱疹病毒。然而,能够分离病毒的细胞系有其自身的局限性;因此,细胞培养分离法在检测锦鲤疱疹病毒DNA时并不像PCR方法那样敏感,不能作为一种可靠的检测方法来进行考虑。还有研究表明,从死亡稍长或冰冻的感染锦鲤组织中很难分离到病毒,若想分离病毒需用新鲜的肾脏做病毒培养,因为肾脏是锦鲤疱疹病毒增毒最高的组织。

抗原检测

1免疫荧光检测

锦鲤疱疹病毒可以通过肝脏、肾脏及感染鱼类脑部的接触印痕及涂片,利用免疫荧光法进行鉴定。应用免疫荧光法在肾脏中可以收获到较高水平的病毒阳性荧光。研究表明,在感染早期应用免疫荧光法可以在肾脏印痕中检测到病毒。

2酶联免疫吸附试验

应用酶联免疫吸附试验(ELISA)在感染器官中直接检测锦鲤疱疹病毒抗原的方法在很多实验室中都尚未发展成熟,一些相关试验还有待于进一步研究。目前,以色列的研究人员建立了在鱼类排泄物(粪便)中检测锦鲤疱疹病毒的ELISA方法。

抗体检测

研究人员抽取鱼的血液进行抗体检测,发现产生抗体的细胞需要一段时间才能激活,而且一旦激活多种鱼类将会产生永久性免疫。鱼体在感染锦鲤疱疹病毒时,其自身免疫状态(特异性免疫与非特异性免疫)在抵御疱疹病毒入侵时起着至关重要的作用;当水温在18℃以上时鱼类的免疫应答处于最佳状态,此时鲤鱼感染病毒后机体所产生的抗体可以抵抗病毒。研究表明,机体在感染病毒3周后,其血清中可以通过ELISA方法检测到抗体的存在,而自然感染病愈1年后的鲤鱼也能检测到这些抗体。虽然,含有锦鲤疱疹病毒抗体的锦鲤血清能与鲤鱼疱疹病毒1型出现交叉反应,但研究人员发现,通过ELISA方法仍能检测到具有较低含量的锦鲤疱疹病毒抗体;因此,免疫学方法可以检测外观十分健康的初期感染者,由于PCR方法在病毒含量较低时容易出现阴性反应,所以免疫学方法检测抗体也许是唯一有效的监测手段。但是,对鱼类病毒感染的免疫学方法研究较少,相信随着血清学诊断技术的日臻完善,应用免疫学方法在假定健康的鱼群中筛选病毒初期感染者将会成为可能。

分子生物学诊断技术

1PCR方法

PCR是比较准确的诊断锦鲤疱疹病毒的方法;因此,国际兽疫局将其列为推荐方法之一。截止到2006年,运用PCR技术确诊的锦鲤疱疹病毒感染的阳性病料在德国有45例、英国16例以上、荷兰1例、美国2例,以色列确诊的病例也是应用此技术完成的。有人用锦鲤疱疹病毒的1个保守片段建立PCR方法,可用来区分锦鲤疱疹病毒、鲤鱼疱疹病毒(CHV)和海峡鲶鱼病毒(CCV)。

2004年,T.Ishioka等运用PCR技术对发生在日本的43份锦鲤疱疹病毒可疑病例进行了分子流行病学检测,之后又利用锦鲤疱疹病毒的主要囊膜蛋白基因和聚合酶基因的核苷酸序列设计了相应引物,并进行PCR扩增。结果表明,有37份样品检出阳性,检出率为86%。有研究人员认为,ORF25编码的蛋白在病毒的突变位点不易发生变化,属于较为保守的基因序列;因此,利用该基因进行PCR检测特异性较高。

H.Ber-covier等用锦鲤疱疹病毒的胸苷激酶基因建立的PCR方法可区分锦鲤疱疹病毒、海峡鲶鱼病毒和鲤鱼疱疹病毒。2002年在广东省爆发的疑似锦鲤疱疹病毒病原感染中,刘荭等人建立的检测方法发挥了积极的作用,同时也预示着我国同样存在受贸易往来所导致的锦鲤疱疹病毒爆发的风险,并提前为我国预防和控制该病提供了技术支持。乌日琴等分别利用2种方法抽提组织中锦鲤疱疹病毒的DNA,证实蛋白酶K-酚/氯仿抽提法不能达到从组织中抽提锦鲤疱疹病毒DNA的目的,同时也评价了2套引物检测的特异性,初步建立了反应快速、操作简便、灵敏度高的检测锦鲤疱疹病毒的PCR方法。孟庆峰等通过使用靶基因序列合成的相关引物检测锦鲤疱疹病毒。

结果表明,所用靶基因均可用于锦鲤疱疹病毒的检测及其确证试验。但是,PCR检测方法也有自身的局限性,它只能从出现临床症状的病鱼体内检测到锦鲤疱疹病毒,还不能预知潜在的病毒感染,同时假阳性、假阴性及气溶胶污染等也给PCR方法带来一些弊端。

2探针检测

对于公布的单循环PCR方法,最近被认为是从临床患病的鲤鱼体内采取新鲜器官样品中检测锦鲤疱疹病毒DNA最为敏感的,该规程同样可以应用于检测具有亚临床症状的病毒,首先应用TK探针发展该规程的是以色列希伯来大学-Hadassah医学院的研究人员。其后日本学者也对此进行了相关研究,并对其进行了改进。研究表明,若使用的器官样品有腐烂迹象,则需要用探针位点靶向基因组的稍短区域。

3环介导等温扩增技术(LAMP)

环介导等温扩增技术是一种新型的恒温核酸扩增方法,它能特异性识别靶核苷酸上6个位点的4对引物及具有链置换活性的DNA聚合酶,在60~65℃条件下进行核酸的指数式扩增,其扩增效率在1×10-9~1×10-10数量级上,其反应的原理是在扩增的过程中产生茎环结构,以保证引物和模板杂交后启动新一轮的扩增反应,反应的副产物焦磷酸镁沉淀是肉眼可见的,若反应中添加显色剂,通过扩增过程颜色的变化,还可以目测整个反应过程。该方法的优点是快速、简便、廉价、肉眼可观测到反应的发生,并且不需要特殊的PCR反应仪器,非常适合现场诊断;因此,该方法有很好的应用前景。H.Soliman等通过设计的3对引物建立了锦鲤疱疹病毒的环介导等温扩增技术,该方法在90min内即可完成,省时、省力并且直观。I.Gunimaladevi等利用锦鲤疱疹病毒胸苷激酶基因设计引物建立的环介导等温扩增技术,其灵敏度与普通PCR方法相当。

结语

传统检测锦鲤疱疹病毒的方法仍为病毒分离鉴定,而分子生物学检测因具有更加灵敏、特异、快速的特点,成为当前检测的发展方向。目前,人们仍致力于研究一些新的检测方法以满足需要,国际上分子生物学检测后的测序正逐渐成为实验室检测的确证试验。随着国际贸易的不断往来,锦鲤疱疹病毒作为水生动物主要疫病越来越被重视;因此,只有未雨绸缪、早做预防,才能减少疫病传入造成的巨大经济损失。

KHV检验方式及应对举措责任编辑:陈老师    阅读:人次