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高温对虾白斑病毒的影响
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作者:吴晓果 熊海涛 杜华华 单位:浙江大学 饲料科学研究所

细胞免疫

对虾血淋巴细胞分为透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞,主要具有吞噬、包囊和胞吐功能,能够合成和释放多种免疫活性因子参与体液免疫[16]。研究发现,30℃高温组的罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)血淋巴细胞的吞噬和清除能力显著高于20℃常温组,说明高温具有促进对虾血淋巴细胞免疫力的作用[17]。而且高温感染组对虾的血淋巴细胞总数显著高于常温感染组[10],表明在高温下感染对虾白斑综合征病毒能诱导宿主细胞非特异性免疫力升高。

体液免疫

对虾等甲壳类动物体内没有类似T淋巴细胞和免疫球蛋白等特异性抗体,酚氧化酶激活系统在对虾非特异性免疫中起着关键作用。酚氧化酶是合成黑色素的关键酶,能诱导多种血淋巴细胞的体液防御反应[18]。在高温下用美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamsel)感染对虾,其酚氧化酶、超氧化物歧化酶、呼吸爆发活性均显著高于常温感染组[19]。高温下感染对虾白斑综合征病毒的日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicas)诱导出的酚氧化酶活性显著高于常温感染组[10]。表明高温条件下感染对虾白斑综合征病毒,对虾的非特异性免疫力高于常温感染组,能够在一定程度上抵御感染。

细胞凋亡

细胞凋亡是高度调控的细胞程序性死亡,在维持多细胞动物细胞稳态、细胞数量和组织大小等方面具有十分重要的作用。在细胞凋亡过程中,细胞内外凋亡信号依靠着一系列精确调控的半胱氨酸蛋白酶介导的酶促级联反应和能量依赖性,最后由半胱氨酸蛋白酶-3执行关键的凋亡程序[20]。在病毒感染宿主细胞的过程中,病毒会激发宿主细胞内的相关感受器,随即激发细胞内的凋亡反应。当病毒感染细胞诱发凋亡后,感染细胞会通过提前溶解,形成凋亡小体并被周围的细胞吞噬,不引起炎症反应,进而起到消灭病毒的作用,所以细胞凋亡在宿主细胞抵抗病毒感染的过程中起着重要作用[21-22]。另一方面,入侵的病毒为了复制更多的子代病毒,会分泌多种抗凋亡蛋白与凋亡通路中的关键蛋白作用,起到阻断或者延迟细胞凋亡的作用[20]。整个病毒感染过程中,宿主细胞的凋亡和病毒蛋白的抗凋亡作用相互对抗,特别是在病毒感染的初期尤为关键。

高温感染对虾白斑综合征病毒诱发的细胞凋亡

在常温下感染对虾白斑综合征病毒后,随着病毒感染程度的加重,斑节对虾(Penaeusmonodon)细胞凋亡指数上升,直至死亡[23]。对人正常皮肤和尖锐湿疣的皮肤局部高温处理后,均检测到了凋亡信号[24],表明病毒和高温均能诱导宿主细胞凋亡。高温感染组的凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)的平均凋亡指数显著高于常温攻毒组(P<0.05),在触角腺、甲壳下上皮组织、结缔组织、心脏、肝胰腺、淋巴器官、心包膜、胃上皮中均检测到了不同程度的细胞凋亡,而到感染后期凋亡指数下降[25]。这个趋势与对虾白斑综合征病毒在高温条件下的增殖趋势一致(结果待发表①),表明细胞凋亡对于对虾白斑综合征病毒在宿主体内的增殖具有一定的抑制作用。在凋亡信号通路中,需要活化一系列的半胱氨酸蛋白酶,最后由半胱氨酸蛋白酶-3执行凋亡程序。目前,已在斑节对虾、墨吉明对虾(Fennero-penaeusmerguiensis)、凡纳滨对虾中成功克隆出了半胱氨酸蛋白酶-3,对虾白斑综合征病毒感染会诱导其表达量显著增加(P<0.05)[26-28]。在日本囊对虾中,用RNAi干扰半胱氨酸蛋白酶后,宿主细胞的凋亡率下降,病毒增殖[29]。进一步表明细胞凋亡对于宿主细胞抵抗对虾白斑综合征病毒感染的重要性。

病毒的抗凋亡作用

研究发现,用非特异性凋亡诱导剂放线菌素D处理细胞后,会诱导细胞出现凋亡,但是用对虾白斑综合征病毒感染后,会抑制细胞凋亡[30]。在细胞凋亡抑制过程中,对虾白斑综合征病毒合成了多个抗凋亡蛋白作用于细胞凋亡途径的不同蛋白。目前发现的对虾白斑综合征病毒抗凋亡基因有ORF390、WSSV222和VP38等,其产物分别通过切割半胱氨酸蛋白酶-3的DEVD272↓G和半胱氨酸蛋白酶-9的VETD233↓G、LEHD303↓G位点、利用泛素化作用介导肿瘤抑制样蛋白降解、抑制半胱氨酸蛋白酶-3启动子的活性来发挥抗凋亡作用[31-33]。但是关于高温与对虾白斑综合征病毒抗凋亡基因作用之间的关系尚未见报道。

热休克蛋白

热休克蛋白具有高保守序列,在各物种中均有表达。热休克蛋白具有折叠、组装、细胞内定位、分泌、调控和降解其他蛋白的作用。根据热休克蛋白的序列同源性和分子质量,将热休克蛋白分为热休克蛋白110、热休克蛋白100、热休克蛋白90、热休克蛋白70、热休克蛋白60、热休克蛋白40、热休克蛋白10和小热休克蛋白家族[34]。生物体受到应激(如高温、氧化应激、细菌、病毒感染等)都会诱导热休克蛋白的表达,而热休克蛋白70家族的基因序列最保守,研究得也最深入,细胞受到应激后变化最显著[35]。热休克蛋白70家族主要包含有组成型热休克蛋白70和诱导型热休克蛋白70[36-37]。在正常环境条件下,组成型热休克蛋白70在各物种中均保持低水平表达,即使在应激条件下,其表达量变化也不显著[38-39]。但在应激条件下,诱导型热休克蛋白70表达量则会显著升高[40-41]。虽然二者在表达模式上差异极大,但结构相似:在N-末端44ku的ATP结合结构域和C-末端30ku的底物结合结构域[42]。目前发现诱导型热休克蛋白70基因缺失内含子,而组成型热休克蛋白70含有内含子[43],这种基因上的结构正好对应诱导型热休克蛋白70,能够在应激状态下快速表达,有效保护细胞免受应激损害。高温能够诱导诱导型热休克蛋白70的表达,提高宿主细胞的耐热性,帮助细胞度过高温应激状态。

1组成型热休克蛋白

70对高温对虾白斑综合征病毒感染的作用目前,已在斑节对虾、中国明对虾(F.chinen-sis)、凡纳滨对虾、罗氏沼虾等主要对虾中克隆出组成型热休克蛋白70,为研究其作用机制提供了丰富的理论基础[44-47]。研究发现,在乳头瘤病毒、腺病毒、轮状病毒感染宿主细胞时,组成型热休克蛋白70能够协助病毒入侵细胞、病毒蛋白组装、降解、细胞转换、病毒DNA复制等[48-50],表明组成型热休克蛋白70能够诱导一些病毒感染宿主细胞。在对虾白斑综合征病毒感染对虾过程中,组成型热休克蛋白70依靠其三磷酸腺苷结合结构域和多肽结合结构域,与对虾白斑综合征病毒系统性感染相关蛋白VP28作用,表现出特异性结合和三磷酸腺苷依耐性,协助其感染宿主细胞[51-52]。在常温下,对虾白斑综合征病毒感染初期,组成型热休克蛋白70的表达量升高,半胱氨酸蛋白酶-3活性很低;但在感染晚期,组成型热休克蛋白70的表达量下降,半胱氨酸蛋白酶-3的活性显著升高;用组成型热休克蛋白70的dsRNA作用对虾白斑综合征病毒感染对虾发现,其细胞内的半胱氨酸蛋白酶-3活性显著升高[53]。这种组成型热休克蛋白70的表达水平与宿主细胞凋亡之间的关系表明,对虾白斑综合征病毒的感染能够诱导宿主组成型热休克蛋白70的表达,进而抑制细胞凋亡,最后病毒顺利增殖。而在高温下,组成型热休克蛋白70的mRNA表达量仅在高温应激的1h内增加2~3倍,0.5h后即恢复至正常水平[44]。前期研究表明,组成型热休克蛋白70受到高温和病毒刺激后的短暂时间内表达量上升,随即恢复到正常水平,但是组成型热休克蛋白70正常表达量较少,所以在高温抑制对虾白斑综合征病毒感染的过程中并不会起主导作用,不会影响整个感染过程。

2诱导型热休克蛋白

70对高温对虾白斑综合征病毒感染的作用诱导型热休克蛋白70是热应激反应的关键效应蛋白,具有高保守性和分子伴侣作用,在细胞内发挥蛋白折叠、细胞周期调控和抗凋亡作用[54]。在罗氏沼虾(GenBankNo:AY466445)、斑节对虾(GenBankNo:AF474375)、凡纳滨对虾(GenBankNo:AY645906)、克氏原螯虾(Procambarusclar-kii)(GenBankNo:DQ301506)等主要养殖对虾中成功地克隆出了诱导型热休克蛋白70。基于这些基因信息,针对高温抑制对虾白斑综合征病毒增殖的分子机制展开工作,能够深入研究诱导型热休克蛋白70的作用。在对流感病毒和仙台病毒的高温研究中发现,诱导型热休克蛋白70能够抑制细胞核释放核糖核酸蛋白复合体来阻止流感病毒的增殖[55];诱导型热休克蛋白70能够破坏HN蛋白的组装来抑制仙台病毒的复制[56]。伴随高温抑制对虾白斑综合征发病的过程,对虾白斑综合征病毒的增殖受到显著的抑制,诱导型热休克蛋白70的mRNA水平和蛋白水平均显著升高;通过特异的RNA干扰作用,诱导型热休克蛋白70的表达水平下降,对虾白斑综合征病毒增殖[57]。这表明诱导型热休克蛋白70的表达升高能够显著抑制对虾白斑综合征病毒的增殖,但是关于二者相互作用的分子机制还有待进一步研究。诱导型热休克蛋白70依赖其ATP结合结构域和多肽结合结构域,能够与线粒体途径的上游和下游关键凋亡蛋白相互作用,抑制细胞外和细胞内凋亡途径[58]。虽然诱导型热休克蛋白70具有一定的抗凋亡作用,但是在高温抑制对虾白斑综合征发病的过程中,细胞凋亡率显著高于常温感染组,对虾白斑综合征病毒增殖数量显著低于常温感染组,表明诱导型热休克蛋白70的抗凋亡作用在高温抑制对虾白斑综合征中作用不显著。诱导型热休克蛋白70和组成型热休克蛋白70同属于热休克蛋白70家族,具有相同的蛋白结构域,已发现组成型热休克蛋白70与对虾白斑综合征病毒的VP28直接作用,那么诱导型热休克蛋白70能否直接与对虾白斑综合征病毒相关蛋白作用,从而抑制其增殖,有待试验进一步证实。

结语

高温条件下病毒感染引起宿主细胞的应激,具有细胞毒性作用,激发了宿主细胞一系列防御机制。非特异性免疫系统是对虾最基本的防御机制,但是其作用有限,还需要其他机制来辅助抵抗应激:一是细胞凋亡的抗病毒作用。当病毒感染宿主细胞后,宿主细胞的凋亡机制和病毒的抗凋亡机制同时存在,两者处于一个相互作用的过程,特别是在病毒感染的初期。二是诱导型热休克蛋白70作用,高温和病毒都能够诱导诱导型热休克蛋白70表达来对抗应激,保护细胞。虽然诱导型热休克蛋白70具有抗凋亡作用,但是在高温感染对虾白斑综合征病毒过程中,以抑制对虾白斑综合征病毒增殖为主,其抑制机制还尚无定论,需要深入研究诱导型热休克蛋白70与对虾白斑综合征病毒何种蛋白相互作用关系,或者还有其他的机制存在。

高温对虾白斑病毒的影响责任编辑:陈老师    阅读:人次
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