棉花幼根水淹的影响分析范文

一般认为，在水淹状态下，植物缺氧，呼吸受阻，乙醇发酵的无氧呼吸作用增强，对植物正常生长发育影响较大甚至导致植物死亡。但植物对逆境的响应表现出积极主动的应激过程，通过相关基因／蛋白的表达变化，在一定程度上来提高个体的抗逆性。研究表明，乙醇脱氢酶（Alcoholdehydro－genase，ADHa）［1－2］和醛脱氢酶（Betaine－aldehydede－hydrogenase，BADH）［3］与植物的抗逆性相关。在棉花发育的初期阶段，水淹是否对其生长产生不利影响，其抗逆性的机制，特别是与ADHa和BADH相关的机制研究还未见报道。本文研究了神农3号棉花在水淹环境下，ADHa和BADH基因相对表达量的变化，为棉花的抗涝机理研究提供数据。

1材料与方法

1．1实验材料神农3号棉花种子由江苏省沿江地区农科所提供，2011年7月种植于花盆土壤中，室温下待幼苗生长至1cm时，随机分为对照组和水淹胁迫组，对照组仍在室温下常规种植培养，水淹组则淹没于水中；各组分别在0h、12h、1d、2d、4d和8d时取根尖处1cm组织待用。

1．2主要试剂与仪器RNAisoPlus总RNA提取试剂盒、SYBR•PrimeScript•RT－PCRKit购自TaKaRa公司，引物由上海英骏公司合成；ABI7500Realtime－PCRSystem；ABI2720型PCR仪；其它各种化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1．3方法

1．3．1总RNA提取。取约1cm长根尖若干于匀浆器中，加入1mLRNAisoPlus充分研磨，至裂解液呈透明状。转入离心管中，室温静置5min，加入0．2mL氯仿，震荡混匀后再室温静置5min，12000×g离心10min，吸取上清液，加入等体积异丙醇混匀，室温静置10min，12000×g离心10min，弃上清液，用75％乙醇洗涤沉淀，12000×g离心5min，弃乙醇，然后用适量的DEPC水溶解RNA。

1．3．2反转录反应。取各个样品总RNA1μL进行反转录，依次加入5×Buffer2μL、Mix0．5μL、随机引物0．5μL、RNA1μL，DEPC水补足至10μL，37℃保温15min，85℃10s终止反应，－20℃保存。1．3．3Real－timePCR反应。根据GenBank中登录的目的基因ADHa（AF085064）、BADH（AY461804）和内参actin（EF464673）序列，应用NCBIPrimer－blast工具（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／tools／primer－blast／index．cgi•LINK＿LOC＝BlastHome）设计引物。引物资料见表1。以上述方法逆转录合成的cDNA为模板，按照SYBR•PrimeScript•RT－PCRKitII试剂盒说明操作，每管总反应体积为25μL，其中cDNA模板2μL，上、下游引物（10pmol•L－1）各1μL，2×MIX12．5μL，水8．5μL。以actin为内参，并设3个重复管，以0h组为参考进行相对定量，ABI7500Softwarev2．0．4进行数据处理，使用Mi－

2结果

2．1水淹对ADHa表达的影响随着时间的延长，ADHa表达量急剧上升，水淹12h时达到第一个高峰；水淹1d时表达下降，水淹3d后ADHa表达量不断升高。与对照相比，胁迫组在各时间段的表达差异均达到极显著水平；其中差异最大的时间段是12h，差异达到8．4倍（图1）。

2．2水淹对BADH表达的影响在水淹12h和1d，胁迫组和对照组表达变化均不显著；水淹2d和4d时2组BADH表达逐渐升高，但对照组高于胁迫组，差异分别达到显著或极显著；水淹8d时2组BADH表达均回落，并且无显著差异（图2）。

3讨论

棉花为世界性的主要农作物，低温、干旱、盐渍、水淹等非生物胁迫的研究已成为热点。罗振等以棉花干物质积累、叶片光合速率、叶绿素荧光参数和叶绿素含量为观察指标，发现盐涝渍单独或双重胁迫均产生不同的影响［4］；李锐等［5］利用双向电泳技术，进行了不同抗冷级别的棉苗低温诱导蛋白表达谱的差异比较，发现了有数十种具有显著差异的蛋白。ADHa是广泛存在于生物体中与醇代谢相关的酶。研究表明，乙醇发酵途径是维持缺氧环境下各项正常生理功能和内部环境所需能量的途径之一［6］。刘登望等［1］观察到水淹时花生根系ADHa活性均有大幅增加；Kato－NoguchiH等观察到4种培育中的水稻在经历48h缺氧胁迫后，不仅胚芽鞘中的乙醇含量上升，ADHa和丙酮酸脱羧酶（PDC）活性也均升高［7］；VuHTT等使用RT－PCR方法观察到水胁迫对水稻ADH（ADH1、ADH2）表达具有显著的促进作用［8］。本实验观察到水淹可刺激棉花幼根ADHa表达迅速上升，在12h时就可达到一个峰值，比对照高出8．4倍。虽然在1d时表达下降，但相比对照而言，差值仍达到4倍。值得注意的是，随着时间的推移，对照组ADHa的表达也在不断升高，其机理目前还不详。本文的结果从另一个角度证实了乙醇发酵是棉花对缺氧的适应表现。植物中存在多种醛脱氢酶［9］，其中甜菜碱醛脱氢酶（BADH）是一种研究较多的醛脱氢酶之一，与多种非生物胁迫相关［10］。李永华等比较了抗旱性不同的小麦品系在不同水胁迫下，不同生长期中BADH的表达水平，认为BADH与抗性相关［11］；通过BADH转基因方法，使得作物获得了更强的抗逆性［12］，罗晓丽等［13］研究发现，BADH转基因棉花株系抗盐和抗冻性能显著提高。朱玉庆等［14］通过转基因方法，将甜菜碱合成中的一种酶－胆碱单氧化物酶（CMO）转化两种棉花品系，发现抗旱性均显著提高。本研究发现，水淹对BADH表达无刺激作用，而且在2d和4d时，表现出显著的抑制作用，提示水淹胁迫对BADH表达的影响可能与其它胁迫的机制不同，还有待进一步探究。