大豆异黄酮的蛋白功能研究范文

《现代食品科技杂志》2014年第七期

1材料与方法

1.1原料低温脱脂豆粕，山东禹王实业有限公司；纯天然大豆异黄酮（>40%），陕西禾博天然产物有限公司；β-葡萄糖苷酶（1200U/g），日本Amano公司。苷元型大豆异黄酮，纯天然大豆异黄酮经β-葡萄糖苷酶水解制备，其它试剂为分析纯或色谱纯。

1.2主要仪器设备Mastersize2000粒度分布仪，英国Malvern公司生产；手提式高温灭菌锅，上海三申医疗器械有限公司生产；T25高速剪切机，德国IKA公司生产；RapidNcube-杜马斯定氮仪，法国Elementar公司生产；2501PC-紫外-可见分光光度计，日本岛津公司生产；CR22G-型冷冻离心机，日本HITACHI公司生产；LeicaTCSSP5激光共聚焦显微镜，德国Leica公司生产。

1.3试验方法

1.3.1富含异黄酮大豆蛋白的制备采用Wang等[10]的方法，以低温脱脂豆粕为原料，采用碱溶酸沉技术提取制备大豆分离蛋白（SPI）。纯天然大豆异黄酮配置成浓度为40mg/mL的体系，再经β-葡萄糖苷酶（1200U/g）水解后制备成苷元型的大豆异黄酮原液。称取一定量的大豆分离蛋白，分别配制成pH2.0~7.0的浓度为2%(m/V)的分散液，9000r/min离心30min后，按照每4mL2%SPI加入0.05mL异黄酮的比例分别加入糖苷型大豆异黄酮及苷元型大豆异黄酮，并于常温充分混合，混合的样品于高压锅120℃处理15min，加热后取出充分混匀后冰浴降至室温，加热的样品记为SPIG（加入了糖苷型异黄酮）和SPIA（加入了苷元型异黄酮），2%蛋白直接高压锅处理记为HSPI。

1.3.2起泡性根据夏宁[11]等报道的方法，略有改动。量取100mL1%蛋白溶液，高速分散均质机以5000r/min的条件均质2min，快速移至250mL量筒内，记录本次泡沫所占的体积并记为V0，依此评估该蛋白溶液起泡能力大小。将装有该蛋白溶液的量筒于30℃水浴静置30min后记录泡沫的残留体积Vr。泡沫稳定性=(Vr/V0)×100%

1.3.3持水性(WHC)[11]1%(m/V)的蛋白溶液5mL移入10mL离心管（已称重），经离心（5000g，30min）后除去上清，称量离心管的质量，蛋白的持水能力（WHC）按照如下公式计算：21WHC/%=(m-m)100/m其中m1为离心管的质量，单位g；m2为去除上清液后离心管的质量，单位g；m为离心管中蛋白质的质量，单位g。

1.3.4溶解度取不同pH的1%的富含异黄酮的大豆蛋白，分散均匀后采用1mol/L的NaOH溶液调节pH为2.0~10.0。经过离心（9000g，30min）后，取上清液测定蛋白质含量。本实验中溶解度记为上清液中的总蛋白含量与样品中的总蛋白含量的比值。冻干后的SPI、Mix、SPIG6.4粉末于0~500℃条件下进行热重分析以比较失重及分解温度。

1.3.5乳液的制备[11~12]为研究中性（pH7.0）条件下加入异黄酮前后大豆蛋白在常温及高温处理后制备的乳液的性质，取大豆分离蛋白（SPI）、热变性大豆分离蛋白（HSPI）、常温混入糖苷型和苷元型异黄酮的大豆蛋白（Mix-SPIG和Mix-SPIA）和热变性富含纯天然大豆异黄酮和苷元型异黄酮的蛋白（SPIG和SPIA），溶液相中分别加入玉米油相(最终的乳液中含有20%（V/V）的玉米油和1%的大豆蛋白。充分混合后经预均质（5000r/min，2min）后，进行高压微射流处理（50MPa），向所制备的乳液中加入0.02%（m/V）NaN3以抑制微生物的生长。

1.3.6乳液平均粒径的测定采用MalvernMastersizer2000激光粒度仪测定乳状液滴的粒径大小。实验中采用颗粒折射率为1.520、颗粒吸收率为0.001以及分散剂折射率为1.330（水）的参数进行测定。表面平均粒径d32与体积平均粒径d43表征乳液粒度的大小。三次重复测定。

1.3.7乳液的微结构[11]取40μL荧染燃料（0.02%尼罗红和0.1%尼罗蓝混合液）加入1mL乳液样品中，充分混合后吸取样品置于带有凹槽的玻璃载玻片上，载玻片固定于载物台后再用100×物镜粗调聚焦平面。选取488nm的Ar离子和633nm的He/Ne离子双通道激光模式采集图像，扫描密度设置为1024×1024。采用LASAFLite软件对图像处理。1.4统计分析数据一般为三次测定的平均值，并采用SPSS软件的一维方差分析的LSD比较样品平均值之间的差异显著性。

2结果与讨论

2.1蛋白的制备不同pH条件下SPI、HSPI及加热制备的富含纯天然大豆异黄酮及苷元型异黄酮的大豆蛋白实物图如图1。

2.2溶解度图2为大豆异黄酮、SPI、HSPI、富含纯天然大豆异黄酮的大豆蛋白及富含苷元型的大豆蛋白的溶解度-pH曲线。图2中的实物图为大豆异黄酮在水中的溶解状态，由箭头所指可见异黄酮在水中溶解度较低。异黄酮结合蛋白后，形成的复合物具有了类似于蛋白的溶解特性。即几种蛋白在pH2.0~pH10.0的条件下，溶解度曲线都呈现马蹄形。在等电点附近即pH4.0~5.0的条件下，几种蛋白的溶解度都是最低；而在高pH即pH8.0和pH10.0的条件下，溶解度呈增加趋势。几种大豆蛋白在碱性条件下溶解性良好。富含异黄酮的大豆蛋白的溶解性低于SPI和HSPI，中性pH条件下的富含纯天然大豆异黄酮的蛋白溶解性优于富含苷元型的大豆异黄酮的溶解性。大豆蛋白加热后疏水集团暴露，在一定程度上可能增加了大豆蛋白与异黄酮的结合能力，从异黄酮的结构来看，苷元型的异黄酮为几种纯天然大豆异黄酮去糖苷基形成，即为更加疏水的异黄酮类型，从而导致加热后的蛋白聚集体中结合了更多的苷元型的异黄酮，蛋白-异黄酮复合物的形成及蛋白纯度下降可能是富含异黄酮大豆蛋白溶解度变化的原因，此机理有待进一步验证。

2.3起泡性SPI、HSPI和富含异黄酮的大豆蛋白的起泡性如图3所示。蛋白质的起泡能力应用食品体系中能增加产品的体积也可以起到酥松的作用[11]。大豆蛋白质分子因为具两亲性结构而在分散液中表现出较强界面活性，急速机械搅拌时大量气体混入，溶液中的蛋白质分子吸附到水-空气界面上，降低界面张力，促进界面形成。同时由于大豆蛋白部分肽链在界面上伸展开来，并通过肽链间相互作用，形成一个二维保护网络而使界面膜得以加强，从而促进泡沫的形成与稳定[13]。从图3a可知，同SPI相比，加热后处理的几种蛋白的发泡能力都有所提高，其中HSPI的发泡能力为172.01±0.66%，强于其它几种蛋白，同时，从图3b可知，加热后蛋白样品的泡沫稳定性相比于SPI有所降低，一方面异黄酮中的糖的存在可能提高粘度，可以一定程度的提高泡沫的稳定[13]，同时加热处理的过程会导致蛋白溶液粘度降低，继而排液速率加快，最终使得泡沫稳定性下降。

2.4持水性富含异黄酮大豆蛋白的持水能力如图4所示。蛋白质的肽链上的亲水集团与水的相互作用对于蛋白质的持水性有重要关系[11]。本研究中SPI的持水能力约为590.00±3.45%，加热处理及加入异黄酮后大豆蛋白的持水能力下降，同时pH6.4处加热制备的富含苷元型异黄酮的大豆蛋白（SPIA6.4）的持水能力最低，即521.56±3.67%，这可能与加热处理导致的蛋白的彻底变性和疏水集团的暴露以及苷元异黄酮的疏水能力有关。

2.5乳化性SPI、HSPI及富含异黄酮大豆蛋白的乳化特性及乳液的微观结构如图5和图6。对于新鲜乳液测定的d43，SPI的粒度为1.35±0.12μm，混合纯天然大豆异黄酮及苷元型异黄酮的蛋白的乳液粒度分别为25.41±1.32μm和24.57±1.73μm。加热后的SPI及SPIG、SPIA的粒度分别为32.14±0.21μm、38.99±0.89μm和34.50±0.48μm。试验条件下，同天然分离蛋白和混合添加异黄酮的蛋白相比，加热法富含异黄酮的蛋白制备的乳液的粒度增大，离心处理后稳定系数有所降低，但该乳液具有更加良好的塑性，与HSPI呈现相似特性，可见热处理对蛋白乳液特性具有重要影响，这与文献报道的结论一致[14]。对于乳液粒度的增大，一方面可能由于高压乳化时首先促进了蛋白质聚集体在界面上的吸附，后因蛋白质聚集体的空间位阻作用，蛋白质分子最终难以完整的覆盖油滴，油滴的再次聚结被阻止，因而加热后的聚集体都出现了较大的液滴[12]；另一方面，大豆异黄酮的加入首先形成了大豆蛋白-异黄酮复合物，加热制备后形成了粒径更大的可溶性聚集体颗粒（图A），由于纯天然大豆异黄酮带有糖侧链，且比苷元型的异黄酮具有更大的分子量，因而形成了几种乳液的粒度差异。图中A-F分别为SPI、Mix-SPIG、Mix-SPIA、HSPI、SPIG和SPIA形成的乳液。由图可知，染色后的乳液的微结构可通过激光共聚焦显微镜观察。经过加热处理后的蛋白（包括加入异黄酮的）都出现了相对较大粒度的油滴，直接混合未加入异黄酮的大豆蛋白乳液比加入异黄酮加热处理的蛋白的油滴较小（图6），该结论与粒度测定的结果相一致。

3结论

本文以SPI与大豆异黄酮为原料，制备了不同pH、不同温度、不同大豆异黄酮类型等条件下的富含异黄酮的大豆蛋白，并考察了各种蛋白的功能性。研究表明，优化的pH条件制备的蛋白可以实现对难溶性的大豆异黄酮的增溶，加热处理对于所制备的蛋白的功能性具有重要的作用。富含异黄酮的大豆蛋白具有相对良好的起泡性、泡沫稳定性、持水性及溶解性，富含纯天然大豆异黄酮的大豆蛋白的持水性、发泡能力、溶解性略优于同原料制备的富含苷元型异黄酮的大豆蛋白。同SPI及混合了异黄酮的大豆蛋白相比，加热后蛋白所制备的乳液粒度增大、离心后乳液稳定系数降低，但相对于天然大豆蛋白，加热后的蛋白制备的乳液具有更加良好的塑性。该蛋白的制备对大异黄酮的增溶及富含异黄酮的功能性饮料的研究提供一定基础。

作者：杨娟王成根彭捷杨晓泉单位：华南理工大学轻工与食品学院