盐度对虾油中蛋白酶系的影响范文

《现代食品科技杂志》2014年第七期

1材料与方法

1.1原料南美白对虾（PenaeusvannameiBoone）的虾头虾壳，由阳江市海达速冻水产有限公司提供，冻存于-20℃备用。

1.2研究方法

1.2.1虾油发酵将虾头虾壳绞碎，加入原料重的5%的食盐混匀，于45℃水浴中自溶（以80r/min震荡）。4h后用纱布过滤得自溶液，测定自溶液的盐度，并补充食盐，分别将自溶液盐度调节至16%、20%和24%。于35℃保温发酵，定期测定各项指标，测定前补加蒸发掉的水分使盐度保持恒定。

1.2.2理化指标测定pH值：以PB-10pH计测定；酸度：参照GB5413.34-2010，采用NaOH滴定法，当滴定至pH为8.3时，计算产品酸度；可溶性固形物：以BK8280糖度计测定，无盐可溶性固形物含量为虾油离心后所测得的可溶性固形物糖度减去产品相应盐度产生的糖度；氨基酸态氮（AAN）：参照GB18186-2000中的甲醛滴定法测定。挥发性盐基氮（TVB-N）和三甲胺（TMA）：采用康微皿法测定[11]。

1.2.3菌落总数按GB/T4789.2-2003方法稍作改进，耐盐细菌和不耐盐细菌分别用含10%盐度和0%盐度的PCA培养基计数。耐盐真菌和不耐盐真菌分别用含10%盐度和0%盐度的PDA培养基计数。

1.2.4蛋白酶活力的测定参照SB/T10317-1999的方法测定。在40℃下10min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为1个活力单位（U）。

1.2.5蛋白酶酶谱电泳样品处理：取15mL虾油，8000r/min离心10min，上清转移至截留分子量为14000Da的透析袋中透析6h。透析完毕后用分子量为20000Da的聚乙二醇覆盖在透析袋外面吸水至透析液体积到1~2mL，将透析液全部转移至2mL离心管中，并用双蒸水定容至2mL。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（NativePAGE）和蛋白质转移：制作电泳胶（分离胶10%，浓缩胶5%），使上述预处理的样品在预冷藏的NativePAGE缓冲液（pH8.3Tris-Gly）中电泳以防因电压过高导致蛋白质变性。调节浓缩胶电压为80V，分离胶电压为100V。电泳完毕后剥胶。提前制作好含0.25%酪蛋白的蛋白酶检测胶（30%凝胶储液2mL，2.5%的酪蛋白1mL，0.05mol/LTris-HCl（pH8.8）2.5mL，ddH2O4.5mL，TEMED10μL，10%AP100μL）。依次在半干转电转移装置的负极板上铺上滤纸，电泳胶，检测胶，再铺上滤纸，并驱除气泡，盖上正极板，以40mA电流转移40min，取出检测胶，于37℃孵育40min，以使酪蛋白充分水解。然后以考马斯亮蓝染色30min后于摇床上震荡脱色过夜。检测胶上的透明条带即为蛋白酶水解带。

1.2.6游离氨基酸的测定参照GB/T5009.124-2003的方法，采用日立-8800型氨基酸自动分析仪检测。色谱柱：日立855-350型；反应柱温：134℃；检测波长：570nm和440nm；流速：0.35mL/min。标准氨基酸为Sigma产品。

1.2.7感官评定方法与标准采用定量描述分析法（QDA）进行感官评定。5个人为一小组，分四个小组，分别对样品的颜色、奶酪味、肉味、氨味、酱香味、腥味、腐臭味进行评价。感官评定成员进行两周，总时间不小于2h的培训。

1.3数据分析所有理化指标进行三次平行测定，采用SPSSStatistics19软件对数据进行单因素方差分析，数据表达成平均值±标准方差。p<0.05认为具有显著差异。

2结果与讨论

2.1盐度对虾油无盐可溶性固形物和AAN的影响图1中，16%盐度的虾油在发酵第10d已明显腐败，所以未继续测定各项指标。其他盐度发酵的虾油在发酵初期20d内无盐可溶性固形物及AAN含量迅速上升，后期相对平稳。无盐可溶性固形物为虾油离心后所测得的糖度减去虾油所含食盐所产生的糖度，可反映虾油可溶性蛋白的趋势。盐度越高，无盐可溶性固形物和AAN含量越小，这表明高盐度会抑制蛋白酶活力，使可溶性蛋白或多肽的生成减少，从而导致游离氨基酸减少。经SPSS软件方差分析可知，盐度对样品的无盐可溶性固形物和AAN含量影响非常显著（p<0.01）。

2.2盐度对虾油pH和酸度的影响图2显示，虾头虾壳自溶液pH在8.0左右，随着发酵的进行，虾油pH逐渐减小，酸度缓慢增加，发酵30d后虾油pH和酸度逐渐稳定在7.5~8.0范围内，且盐度越大，pH及酸度变化幅度越小，推测上述变化与蛋白质水解产生游离氨基酸和肽有关。经SPSS软件方差分析可知，盐度对样品pH和酸度影响显著（p<0.05）。

2.3盐度对虾油TVB-N和TMA的影响图3显示，虾油的TVB-N和TMA的含量随发酵时间的变化相似，在发酵前期20d内快速增加，以后渐趋平稳；且盐度越高TVB-N和TMA的含量越低，16%盐度的虾油发酵至第10d时，TVB-N和TMA含量已分别剧增至0.61mg/mL和0.09mg/mL，而20%和24%盐度的虾油TVB-N和TMA含量一直分别保持在0.45mg/mL和0.04mg/mL以下。TVB-N和TMA分别由细菌等微生物分解氨基酸、氧化三甲胺等物质产生，盐度越高对细菌等微生物的抑制作用越强；同时图1显示高盐度时游离氨基酸的生成减少，细菌分解的底物减少，这些原因都会导致TVB-N和TMA含量降低。经SPSS软件方差分析可知，盐度对虾油TVB-N和TMA含量影响非常显著（p<0.01）。

2.4盐度对虾油中微生物的影响图4显示，发酵初期10d内耐盐细菌的数量小于不耐盐细菌，10d后耐盐细菌快速增加，超过不耐盐细菌成为优势菌。还可发现20%盐度的虾油中耐盐细菌的数量远高于24%盐度的虾油。经SPSS软件方差分析可知，盐度对虾油的耐盐细菌和不耐盐细菌的数量影响非常显著（p<0.01）。表1显示，虾头虾壳自溶液中耐盐和不耐盐真菌都很少，约103cfu/mL，在发酵过程中，真菌的数量降至30cfu/mL以下，在很多样品中甚至检测不到。这说明在虾油发酵过程中真菌几乎不起作用。黄紫燕等[12]研究发现鱼露的中嗜盐酵母菌为优势菌，这与本研究的结果不同，推测这种差异与原料差异有关，因鱼露发酵过程中pH一般保持在4.5~6.0；而本研究的虾油在发酵过程中pH一直在7.5~8.0范围内，一般来说，略偏酸性的环境有利于真菌的生长繁殖。

2.5盐度对虾油蛋白酶活力和组成的影响图5盐度对虾油蛋白酶活力的影响Fig.5Influenceofsalinityonproteaseactivityduringfermentationofshrimpsauce虾油总蛋白酶包括虾油内源蛋白酶和微生物产的外源蛋白酶。发酵10d内，总蛋白酶活力下降，10d后总蛋白酶活力上升，在发酵30d后趋于平衡。这种变化与图4中细菌数量的变化趋势相似，推测是发酵初期10d内，虾油中部分内源蛋白酶在高盐度下逐渐失活，同时细菌数量很少且呈下降趋势，导致的发酵10d内总蛋白酶活力呈现下降趋势。10d后细菌数量明显增加，产生了新的蛋白酶，使总蛋白酶活力明显上升。图5显示盐度越高蛋白酶活力越低，说明高盐度会抑制蛋白酶活力，Klomklao等[13]对鱼露的研究也得出相似结论。经SPSS软件方差分析可知，盐度对蛋白酶活力影响非常显著（p<0.01）。图6是各种盐度发酵的虾油在不同时期的蛋白酶电泳图谱，从谱带亮度可知蛋白酶活力大小为20%盐度>24%盐度，这与图5中蛋白酶活力测定的结果一致。虾油内源蛋白酶（虾头虾壳自溶液中的蛋白酶）有4种（1、2、3和4号），2、3、4号蛋白酶活力逐渐减小，只有1号蛋白酶活力没有明显下降，这也解释了图5中，虾油在发酵10d内蛋白酶活力逐渐减小的现象。随着发酵时间延长，虾油中逐渐出现了自溶液中原本没有的蛋白酶，发酵第5d时产生了新的蛋白酶（5、6、7、8号），第60d出现了新的蛋白酶（9和10号），这说明发酵过程中的微生物产生了蛋白酶。由于表2显示真菌几乎不起作用，所以新的蛋白酶很可能是图4显示的，发酵10d后迅速增加的耐盐细菌产生的。综上可知，虾油发酵过程中内源蛋白酶和细菌蛋白酶交替作用，细菌蛋白酶对发酵的贡献不可忽视。

2.6盐度对虾油游离氨基酸组成的影响由表2知，虾油游离氨基酸种类丰富，尤其富含天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸等甜味和鲜味氨基酸。20%盐度和24%盐度的虾油甜味，甜味，鲜味和苦味氨基酸所占比例相当。但20%盐度的虾油中鸟氨酸、氨基乙醇、胱硫醚和氨等臭味和氨味等物质占比均高于24%盐度的虾油，且图3显示20%的虾油TVB-N和TMA含量也高于24%盐度放入虾油，这说明20%盐度时尚有微弱的腐败作用发生，导致虾油中产生一些不良风味成分。

2.7盐度对虾油感官评定的影响由表3的感官评定知，16%盐度不能有效抑制腐败，因此不适合发酵虾油；20%以上盐度才能有效抑制腐败。20%盐度发酵90d的虾油酱香味和奶酪味较淡，夹杂着腥臭味和较浓的氨味；24%盐度发酵的虾油香气浓郁，酱香味突出，肉味和鲜味明显，酸臭味和腥味等不良风味较淡，且表2显示的其鲜味，甜味和苦味呈味氨基酸比例协调，综合风味较20%盐度虾油好。

3结论

本论文研究表明，虾油发酵的盐度需达到20%以上，否则将发生腐败，但盐度越高蛋白酶活力降低明显，游离氨基酸的生成速度降低，综合考虑防腐、风味形成等因素，24%盐度是发酵虾油的最佳盐度。虾油发酵过程中内源蛋白酶活力逐渐降低，细菌蛋白酶活力逐渐增加，并发挥重要作用；真菌对虾油的发酵基本不起作用。

作者：段杉胡小喜廖广强吴永和邝浩斌杨柳李婷周幸芝单位：华南农业大学食品学院