可食用生物膜载体的制备范文

《食品科学杂志》2015年第二十四期

摘要：

为拓展乳酸菌生物膜在食品领域的应用，构建可食用型高分子载体，本文以可介导乳酸菌粘附的氨基酸为配体，将其修饰在海藻酸钠材料上，通过核磁、氨基酸含量、ζ电势和水接触角等检测表征载体性质，培养马奶酒样乳杆菌ZW3，研究载体对乳杆菌生长和胞外多糖分泌的促进作用。结果显示：培养4d后，精氨酸修饰载体表面乳杆菌数量达到3.8×107CFU/cm2，是赖氨酸修饰载体的3.5倍；同时胞外多糖分泌量达到28.2μg/cm2，是赖氨酸修饰载体的2.4倍。与赖氨酸修饰载体相比，精氨酸修饰载体更有利于乳杆菌的生长和胞外多糖的分泌。该结果表明可以通过配体种类的选择促进乳酸菌生物膜的形成。

关键词

氨基酸；海藻酸钠；生物膜；乳酸菌；配体

细菌生物膜由于菌体间特殊的排列结构和胞外聚合物的保护作用，能使细菌更好地生存和适应环境。与游离状态的细菌相比，生物膜具有良好的系统稳定性和对一些不利环境的抗逆性[1]。乳酸菌作为有益菌中重要的一类，具有良好的发酵特性、食品保藏性能、营养价值和保健作用[2]。研究证明乳酸菌生物膜形式可提高发酵产率和体系稳定性[3-4]，增加对不良因素的耐受性等[5-6]。如果能将乳酸菌以生物膜的形式添加到食品中，必将在改善人类健康方面发挥更大的作用[7]。为形成高效稳定的乳酸菌生物膜，除培养条件的调控外，最重要的是载体性质对生物膜形成的诱导作用。这是由于生物膜的形成起始于菌表面粘附素与材料表面的粘附，进而分泌胞外聚合物将自身包绕其中而形成。然而，目前研究所使用的载体多为商业化产品，如玻璃、陶瓷片、不锈钢和塑料[8-11]等。该类载体多为非可食用型材料，其结构性质限制了乳酸菌生物膜在食品添加领域的应用。一些小分子物质可以介导乳酸菌的粘附，如单克隆抗体、抗生素和氨基酸[12-15]等。其中，氨基酸类配体生物相容性好，食用安全，结构易于修饰，最重要的是不会对乳酸菌的活性造成负面影响。因此，本研究将氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）修饰在天然高分子材料（如海藻酸钠等）上，培养马奶酒样乳杆菌ZW3，考察生物膜形成情况。研究成果将为乳酸菌生物膜更广泛地应用于食品领域提供实验数据和理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂海藻酸钠购于天津市博迪化工有限公司，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购于北京伊诺凯科技有限公司，精氨酸盐酸盐、赖氨酸盐酸盐和3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）购于sigma。2-吗啉乙磺酸（MES）、浓硫酸和噻唑蓝（MTT）等试剂均为分析纯。

1.1.2培养基改良MRS：乳糖4g，葡萄糖16g，酵母浸粉45g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰0.2g，氯化钠0.1g，半胱氨酸盐酸盐1g，乙酸钠15g，吐温-801g，调节pH6.2，定容至1L，115℃高压灭菌20min。

1.1.3菌种马奶酒样乳杆菌ZW3（LactobacilluskefiranofaciensZW3）分离自西藏灵菇，为本实验自主分离、保藏菌种，保存于-80℃冰箱，改良MRS培养基30℃活化2代即可使用。

1.1.4仪器与设备MultiskanGO酶标仪：芬兰ThermoFisherScientific公司；AvanceIII核磁共振波普仪：德国Bruker公司；JY-82水接触角仪：北京哈科试验仪器厂；Mastersizer3000激光粒度仪：英国Malvern公司；SU-1510扫描电镜：日本hitachi公司。

1.2方法

1.2.1氨基酸修饰海藻酸钠的制备将250mg海藻酸钠（Alg）溶解于50mLMES缓冲液（pH=6.5）中，冰水浴条件下加入125mgEDC和75mgNHS活化30min，加入300mg赖氨酸盐酸盐或250mg精氨酸盐酸盐，用1mol/L的氢氧化钠调节溶液pH至7.5，避光反应24h。将反应液对水透析72h，冻干，得到氨基酸修饰海藻酸钠材料（Alg-Lys、Alg-Arg）。

1.2.2氨基酸修饰海藻酸钠的表征Alg、Alg-Lys和Alg-Arg的材料结构与组成通过核磁检测（400MHz，D2O）；氨基酸含量通过水合茚三酮法测定，检测波长570nm；将材料配成1mg/mL溶液，采用激光粒度仪测定ζ电势。

1.2.3载体的固载将圆形盖玻片（直径=15mm）依次用无水乙醇、丙酮、双蒸水超声清洗10min，110℃烘干。将烘干的盖玻片浸泡在50mL新鲜配置的食人鱼溶液（H2O2:浓H2SO4=3:7）中，30min后用大量水洗至中性，110℃烘干冷至室温。将盖玻片浸入2%的APTES无水丙酮溶液中2h，依次用无水丙酮、乙醇、双蒸水超声清洗,烘干，冷却至室温待用。将1%（w/v）的Alg、Alg-Lys和Alg-Arg分别溶于MES缓冲液中，以1.2.1相同的方法进行EDC、NHS活化，加入到盖玻片上，反应24h，用蒸馏水清洗，37℃烘干待用。

1.2.4载体表征固载有Alg、Alg-Lys和Alg-Arg载体的亲疏水性通过静态水接触角仪测定，表征载体水接触角。

1.2.5乳杆菌生物膜形成实验将固载有Alg、Alg-Lys和Alg-Arg的载体放置在24孔板中，紫外照射灭菌；将培养至稳定期的马奶酒样乳杆菌ZW3以1%的接种率添加到新鲜的改良MRS培养基中[16]，1mL/孔接种到载体上，每2d更换新鲜的培养基，30℃厌氧培养2、3、4d后磷酸缓冲溶液（PBS）清洗，MTT染色，孵育4h后用DMSO溶解，酶标仪490nm检测吸光度。涂板计数活菌数量；将菌液梯度稀释，以相同方法进行MTT染色，以活菌数~吸光度标准曲线计算载体表面活菌数。

1.2.6生物膜胞外多糖含量检测将厌氧培养至2、3、4d的生物膜用PBS清洗，每孔加入200μL蒸馏水、100μL6%苯酚溶液和500μL浓硫酸，静止10min，25℃摇匀20min，酶标仪490nm检测吸光度，扣除胞内多糖吸光度。以不同浓度葡萄糖溶液~吸光度标准曲线计算载体表面多糖含量。

1.2.7扫描电镜观察将培养至4d的生物膜用PBS清洗，加入2.5%戊二醛溶液固定30min，PBS清洗2次，室温晾干，喷金，电镜观察形貌。

1.2.8数据分析数据代表3次独立实验结果，以平均值±SD表示。统计分析采用Origin8.0软件计算，以双尾配对学生t检验比较显著性差异，P<0.05代表具有显著差异，P<0.01代表具有极显著差异。

2结果与分析

2.1氨基酸修饰海藻酸钠的制备及表征氨基酸修饰海藻酸钠核磁对比谱图如图1所示，Alg核磁谱图中3.5-4.0ppm为Alg糖环上氢的吸收峰，而Al-Arg和Alg-Lys谱图中1.5-2.0、2.8-3.0ppm分别出现氨基酸上亚甲基氢的吸收峰[17]，说明材料合成成功。通过水合茚三酮法检测制备材料的氨基酸含量，结果如表1所示：Alg中未发现含有氨基酸，而Alg-Arg和Alg-Lys中氨基酸含量均约为17%，含量接近。研究表明材料的表面电荷会对细菌粘附造成影响[18]。通过与Alg相比，发现Alg-Arg和Alg-Lys的ζ电势均显著提高，这是由于Arg和Lys均为碱性氨基酸，通常情况下容易带正电荷。但Alg-Arg和Alg-Lys材料总体仍呈负电性，两修饰材料电势无明显差异，可在同等水平上进行载体固载。

2.2载体的固载及表征由于氨基酸修饰海藻酸钠材料为水溶性材料，为便于研究，本文将其固载于玻璃载体上进行后续性质研究，反应过程如图2所示。除表面电荷，载体的亲疏水性也会对细菌粘附造成影响[18]。因此，通过比较修饰载体的水接触角发现（表2），Alg-Arg和Alg-Lys的水接触角较Alg降低，这是由于Arg和Lys分别含有胍基和氨基等极性基团，均为亲水性氨基酸。该结果说明材料固载成功，且两者间无显著差异，不会对细菌生物膜的形成产生影响。

2.3生物膜形成实验马奶酒样乳杆菌ZW3为本组自主分离自西藏灵菇的的新菌种，其形成生物膜的性质还未被研究。通过静态厌氧培养，ZW3可在Alg-Arg和Alg-Lys载体表面粘附，并持续生长，而在Alg载体表面则无生长（如图3所示）。培养2d后三种载体表面的活菌数量无显著差异，这可能与ZW3菌生长周期较长（2d）有关。3d后Alg-Arg、Alg-Lys载体表面活菌数量显著提高，以Alg-Arg载体最为突出，活菌数是Alg载体的2.3倍。而4d后，Alg载体表面活菌数量下降，这说明Alg载体可能不是乳杆菌ZW3生物膜形成的适宜载体。已有文献报道亲水性阴离子载体与某些细菌的结合能力较弱[19]；而Alg-Arg和Alg-Lys载体表面活菌数量持续上升，说明乳杆菌ZW3可能在载体表面形成了生物膜结构，促进了菌体的生长。其生长趋势与卢志山等报道的粪肠球菌生物膜菌体生长情况一致[20]。其中Alg-Arg的优势仍然最为明显，活菌数是Alg载体的3.5倍，达到3.8×107CFU/cm2，也与王坤等报道的混菌不锈钢网布密度相近[21]。图3Jin[14]等曾报道Arg和Lys修饰的磁性纳米粒子都能和革兰氏阳性菌（芽孢杆菌）快速结合，10min内可富集107CFU/mL。但本研究结果显示Arg修饰载体在ZW3生物膜形成能力上明显优于Lys修饰载体。这可能是由于结合只是生物膜形成初期的关键一步[22]，表现为Alg-Arg和Alg-Lys载体表面早期（2d）菌体数量无显著差异。而形成稳定的生物膜还取决于多种因素（如胞外多糖、蛋白的分泌等）的共同影响，进而导致后期（3-4d）产生显著差异。为验证这一推测，本研究又进行了胞外多糖含量的测定。

2.4生物膜胞外多糖含量检测ZW3本身具有良好的产胞外多糖特性[23]，其不溶性胞外多糖是生物膜的主要成分，在生物膜形成过程中发挥重要作用，决定生物膜的结构、细菌生长外环境等[24-25]。不同载体表面胞外多糖的分泌量如图4所示，2d后Alg-Arg和Alg-Lys载体表面胞外多糖含量明显高于Alg载体，这为两载体表面活菌数量的增长奠定了基础；3和4d后各载体表面胞外多糖含量趋势与细菌量基本一致，很好地印证了胞外多糖对生物膜形成的作用。4d后Alg-Arg表面胞外多糖含量为Alg-Lys的2.4倍，这可能一定程度上解释Arg修饰载体在ZW3生物膜形成能力上明显优于Lys修饰载体。

2.5扫描电镜观察Alg-Arg和Alg-Lys载体表面是否形成ZW3生物膜，可通过形貌观察进行判断。如图5所示，Alg载体表面乳杆菌数量稀少，且呈分散分布，未形成明显的生物膜结构，其结果与2.3、2.4相吻合；而Alg-Arg和Alg-Lys载体表面乳杆菌数量明显增加，菌体紧密聚集，形成团块状结构。可以看到菌体间有错落的生物膜通道（图5-B中箭头所示），这是生物膜传送营养和信息的重要结构。菌体间片状物质可能主要为分泌的胞外物质。

3结论

综上所述，本文成功合成氨基酸修饰海藻酸钠载体，并通过核磁、氨基酸含量、ζ电势和水接触角等表征载体性质，在物理性质基本一致的条件下比较Alg-Arg和Alg-Lys促进乳酸菌生物膜形成的能力。结果发现Alg-Arg和Alg-Lys载体均可以促进马奶酒样乳杆菌ZW3的生长，进而分泌胞外多糖，形成生物膜。其中，Alg-Arg载体效果优于Alg-Lys载体。因此，氨基酸修饰海藻酸钠载体可作为一种食用性乳酸菌生物膜载体，应用于食品领域。该研究表明可以通过配体种类的选择促进乳酸菌生物膜的形成。

参考文献：

[1]CHEOWWS,CHANGMW,HADINOTOK.Antibacterialefficacyofinhalableantibiotic-encapsulatedbiodegradablepolymericnanoparticlesagainstE.colibiofilmcells[J].JournalofBiomedicalNanotechnology,2010,6(4):391-403.Doi:10.1166/jbn.2010.1116

[2]CARRFJ,CHILLD,MAIDAN.Thelacticacidbacteria:Aliteraturesurvey[J].CriticalReviewsinMicrobiology,2002,28(4):281-370.Doi:10.1080/1040-840291046759

[3]RANGASWAMYV,RAMAKRISHNASV.LacticacidproductionbyLactobacillusdelbrueckiiinadualreactorsystemusingpackedbedbiofilmreactor[J].AppliedMicrobiology,2008,46(6):661-666.Doi:10.1111/j.1472-765x.2008.02362.x

[4]ABEA,FURUKAWAS,WATANABES,MORINAGAY.Yeastsandlacticacidbacteriamixed-speciebiofilmformationisapromisingcellimmobilizationtechnologyforethanolfermentation[J].AppliedBiochemistryBiotechnology,2013,171(1):72-79.Doi:10.1007/s12010-013-0360-6

[5]玛依诺-木图拉,王坤,陈晓红,等.嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混菌生物膜发酵特性及其抗逆性[J].食品科学,2013,34(03):169-172.

[6]KUBOTAH,SENDAS,TOKUDAH,etal.StressresistanceofbiofilmandplanktonicLactobacillusplantarumsnbspplantarumJCM1149[J].FoodMicrobiology,2009,26(6):592-597.Doi:10.1016/j.fm.2009.04.001

[7]KIEWTY,CHEOWWS,HADINOTOK.ImportanceofbiofilmageandgrowthmediumontheviabilityofprobioticcapsulescontainingLactobacillusrhamnosusGGbiofilm[J].LWT-FoodScienceandTechnology,2014,59(2):956-963.Doi:10.1016/j.lwt.2014.07.053

[8]BONSAGLIAECR,SILVANCC,FERNADESJÚNIORA,etal.ProductionofbiofilmbyListeriamonocytogenesindifferentmaterialsandtemperatures[J].FoodControl,2014,35(1):386-391.Doi:10.1016/j.foodcont.2013.07.023

[9]CAMPOCCIAD,MONTANAROL,ARCIOLACR.Areviewoftheclinicalimplicationsofanti-infectivebiomaterialsandinfection-resistantsurfaces[J].Biomaterials,2013,34(33):8018-8029.Doi:10.1016/j.biomaterials.2013.07.048

[10]IBARRECHEMP,CASTELLANOP,VIGNOLOG.Evaluationofanti-ListeriameatborneLactobacillusforbiofilmformationonselectedabioticsurfaces[J].MeatScience,2014,96(1):295-303.Doi:10.1016/j.meatsci.2013.07.010

[11]SPERANZAB,SINIGAGLIAM,CORBOMR.Nonstarterlacticacidbacteriabiofilms:AmeanstocontrolthegrowthofListeriamonocytogenesinsoftcheese[J].FoodControl,2009,20(11):1063-1067.Doi:10.1016/j.foodcont.2009.01.006

[12]QIUJM,ZHOUY,CHENH,etal.Immunomagneticseparationandrapiddetectionofbacteriausingbioluminescenceandmicrofluidics[J].Talanta,2009,79(3):787-795.Doi:10.1016/j.talanta.2009.05.003

[13]KELLAJ,STEWARTG,RYANS,etal.Vancomycinmodifiednanoparticlesforefficienttargetingandpreconcentrationofgram-positiveandgram-negativebacteria[J].AcsNano,2008,2(9):1777-1788.Doi:10.1021/nn700183g

[14]JINYJ,LIUF,SHANC,etal.Efficientbacterialcapturewithaminoacidmodifiedmagneticnanoparticles[J].WaterResearch,2014,50:124-134.Doi:10.1016/j.watres.2013.11.045

[15]ROTEMS,RAZN,KASHIY,etal.Oligoacyllysinesurfacesbacterialcapturebypeptide-mimetic[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2010,76(10):3301-3307.Doi:10.1128/AEM.00532-10

[16]任晓镤,李明杨,任少东,等.诱导植物乳杆菌生物膜形成的环境因素探索[J].食品与发酵工业,2014,40(7):11-16.Doi:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2014.07.021

[17]ZHUHG,JIJ,LINRJ,etal.Surfaceengineeringofpoly(D,L-lacticacid)byentrapmentofalginate-aminoacidderivativesforpromotionofchondrogenesis[J].Biomaterials,2002,23(15):3141-3148.Doi:10.1016/s0142-9612(02)00058-3

[18]LORITEGS,RODRIGUESCM,DESOUZAAA,etal.TheroleofconditioningfilmformationandsurfacechemicalchangesonXylellafastidiosaadhesionandbiofilmevolution[J].JournalofColloidandInterfaceScience,2011,359(1):289-295.Doi:10.1016/j.jcis.2011.03.066

[19]FLETCHERM,LOEBGI.Influenceofsubstratumcharacteristicsontheattachmentofamarinepseudomonadtosolidsurfaces[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1979,37(1):67-72.Doi:

[20]卢志山,柳忠豪,孟磊,等.胞外多糖对粪肠球菌单菌种生物膜形成的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2013,23(1):21-24.Doi

[21]王坤,闫颖娟,姜梅,等.保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌生物膜形成研究[J].食品科学,2011,32(19):184-187.Doi:

[22]JOHNSONLR.Microcolonyandbiofilmformationasasurvivalstrategyforbacteria[J].Journaloftheoreticalbiology,2008,251(1):24-34．Doi:10.1016/j.jtbi.2007.10.039

[23]WANGYP,AHMEDZ,FENGW,etal.PhysicochemicalpropertiesofexopolysaccharideproducedbyLactobacilluskefiranofaciensZW3isolatedfromTibetkefir[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2008,43(3):283-288.Doi:10.1016/j.ijbiomac.2008.06.011

[24]XIAOJ,KLEINMI,FALSETTAML,etal.Theexopolysaccharidematrixmodulatestheinteractionbetween3Darchitectureandvirulenceofamixed-speciesoralbiofilm[J].PlosPathogens,2012,8(4):e1002623.Doi:10.1371/journal.ppat.1002623

[25]胡涛,葛剑平,徐蓉蓉,等.粘液放线菌生物膜结构中细菌和胞外多糖关系的初步研究[J].四川大学学报(医学版),2006,37(2):180-182.

作者：孙也 王艳萍  李淑雅 刘兆贤 刘媛 单位：天津科技大学食品工程与生物技术学院