针叶树根腐病的研究进展范文

《生物技术通报杂志》2014年第七期

1大伏革菌介绍

大伏革菌隶属于担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、多孔菌目（Polyporales）、原毛平革菌科（Phanerochaetaceae），是一种常见的木材腐朽菌。在自然环境中，大伏革菌子实体通常生长在树桩和倒木上，其生长对湿度的要求较高。一般情况下，被侵染树桩在1年后开始出现子实体，3-4年后子实体成熟［22］。成熟的子实体开始产生担孢子，担孢子是侵染树木的主要形态，它能够被广泛的传播，在距离产孢中心250m远的地方均有担孢子出现。担孢子大多在晚上释放，影响其形成速率的主要因素有温度和空气湿度等。另外，大伏革菌经过菌丝断裂过程可以产生无性孢子，无性孢子也可以侵染树桩，但到目前为止，关于无性孢子传播方式的研究较少。大伏革菌菌株有同核体和异核体之分，同核体是指在菌丝体中细胞核的基因型相同，它是由基因型相同的菌丝融合而成；异核体是指带有不同遗传性状的两个单倍体菌丝相互融合，导致菌丝体中并存有两种或以上不同遗传型的核。大伏革菌同核体和异核体菌株之间在形态上无明显区别，但在性质上有较大差异，特别是在防治病原菌方面，同核体菌株的孢子产量比异核体菌株大得多，但只能在室内实验室条件下防治异担子菌，其生长速率和防治效率均比异核体菌株小，在林地中易退化［23，24］，故在防治异担子菌中没有实际应用价值。因此，目前无论进行室内研究还是生产商业制剂均采用异核体菌株。

2大伏革菌防病历史及商业化菌剂发展

1950年，英国人Rishbeth［20］首先提出用大伏革菌防治异担子菌，大伏革菌可以像异担子菌一样侵染树木活组织，通过优先占领生态位来控制异担子菌在该树桩上的生长，其侵染过程不依靠其他微生物的辅助作用。大伏革菌在自然状态下侵染松树的概率很高，这样可以保护松树免受异担子菌侵染。在英国，大伏革菌侵染树桩概率和侵染面积均比异担子菌高，但两者侵染树桩的季节不一样，大伏革菌孢子对于干燥的环境更敏感，在温暖且极其干燥的情况下，大伏革菌产孢率降低，与异担子菌间竞争减弱，导致异担子菌大范围侵染树桩。在芬兰，大伏革菌和异担子菌孢子出现的时间大致相同，在5月末到8月末大伏革菌孢子出现概率最大，此时可以显著降低异担子菌的侵染率。Meredith［25］通过试验证明，大伏革菌孢子即使比异担子菌孢子沉降低，也可以降低异担子菌侵染面积。最初应用大伏革菌作为生防剂时，在接种量和应用剂型方面还难以把握。1963年，Rishbeth［22］制作了片状的生防剂，用以溶解稀释后喷洒于伐桩表面。试验得出在20℃条件下，溶解稀释后的孢子悬浮液在48h后孢子活力没有显著降低，但实际应用中建议现用现配。此剂型主要缺点是在森林中使用时至少要提前1h水化，实际常常需要通宵浸泡。1968年，Rishbeth优化了生防剂型，以乳化油替代了片剂应用于森林中［9］，但乳化油较易污染，很难维持无菌状态。1970年，产品被重新包装，新的包装形式是将孢子悬浮液混合于蔗糖溶液中，将此混合物密封于聚氯乙烯小袋中，此商品克服了过去出现的问题，且保存时间长。因此，英国人将该混合物发展为商业化菌剂，商品注册名为“PGS”［26］。PGS只能施用于松树上，在4℃条件下保存7个月。此后，多个国家（如保加利亚、加拿大、芬兰、法国、德国和波兰等）将此商品应用于林地进行野外防治，取得了较好效果。与此同时，各国科学家们都在研究适合自己国家的生物防治菌剂。1970年，波兰商业化的生防菌剂产生，注册名为“IBL”。此商品是将大伏革菌的孢子和菌丝接种于灭菌后的山毛榉木屑中，将此混合物放于聚乙烯的小袋中，可应用于松树和云杉上，在干燥低温环境下可存放1年。1991年，芬兰科学家从云杉树桩上分离得到一株异核体大伏革菌，将其做成可湿性粉剂，混合硅胶后，密闭封存在箔衬袋中，此商品注册名为“Rotstop”，其可应用于松树和云杉上，在零下18℃条件下可存放18个月；8℃下存放1年；室温下可存放1星期。但打开包装后必须在24h内使用［26］。与此同时，美国也生产了大伏革菌商品化制剂，但是未获得认可。在Fennos-candia地区，每年有62000hm2的欧洲云杉使用大伏革菌来防治异担子菌；在整个欧洲，每年有超过20万棵树木使用此方法来进行根腐病的防治［27，28］。中国对针叶树干基腐朽病的防治研究较少。作者于2012年在中国东北林区及云南省广泛采集和分离野生大伏革菌，并且通过室内培养基及木桩实验，对比了我国的和国外引进的野生大伏革菌对中国小孔异担子菌的防治效率。实验结果表明，中国大伏革菌防治小孔异担子菌的效率较国外大伏革菌差。

3大伏革菌防病机制

早期研究表明，大伏革菌抗异担子菌的机制可能有3种：菌丝干涉、营养竞争和诱导寄主抗性。

3.1菌丝干涉菌丝干涉是在真菌竞争间普遍存在的一种现象，大伏革菌能够引起异担子菌菌丝结构及功能变化，在一定程度上造成异担子菌死亡。它们之间的菌丝干涉模式和Ascoboluscrenulatus与Coprinusheptemerus之间干涉模式相似，即在两者接触区域，质膜内陷，形成超大的质膜囊泡，细胞里的内含物通过此囊泡外泄，细胞逐渐瓦解、死亡，而且在两者接触区域无可见的线粒体，连结线粒体的电子致密物质沉积［29，30］。Mgbeahuruike等［31］在2013年指出，大伏革菌培养过程中分泌的微小粒子能够抑制异担子菌早期葡萄糖代谢过程的关键酶表达。同时，由于大伏革菌的干涉作用，两种菌丝交互作用中异担子菌编码信号转导过程中的关键蛋白的基因表达水平降低，使其竞争力减弱。

3.2营养竞争大伏革菌作为营养竞争者，通常和病原菌之间竞争碳、氮和铁等营养元素，进而限制其增长，营养竞争的关键在于其能够快速的在树桩上定殖，占领更多的生态位，致使异担子菌不能够继续侵染树桩。Käärik和Rennerfelt［32］在1957年证实大伏革菌比异担子菌能更快的侵染树桩，也能在已被病原菌侵染的树桩上代替异担子菌。这和大伏革菌胞外酶的分泌有必然联系，因为大伏革菌作为一种常见的木材腐朽菌，能够产生许多胞外酶，这些酶可以降解木材组织，利用降解产物来满足自身对于营养物质的需求，同时达到定殖于树木上的目的。一般情况下，不同大伏革菌菌株产生某种酶的酶活性不一样，酶活越高，定殖树木的速率就越大，生物防治的潜能也就越大。大伏革菌产生的胞外酶有：脱氢酶、磷酸酶、纤维素酶、漆酶和通用过氧化物酶等。Anna等［33］在2008年指出，大伏革菌产生的漆酶较少，过氧物酶、纤维素酶、磷酸酶和脱氢酶含量高。漆酶主要参与木质素氧化和杀菌的酚类物质降解和脱毒过程，大伏革菌缺少漆酶就说明大伏革菌不是致病菌。另外，大伏革菌产生P2O酶，该酶参与到木质纤维素的氧化解聚中，主要作用方式是给过氧化物酶（木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶）提供H2O2［34］。一般情况下，呼吸酶的活性（如脱氢酶和磷酸酶）可以作为真菌降解过程强弱的量度，磷酸酶的活性受脱氢酶的影响。2000年，Varela和Martinez［35］在大伏革菌中发现木质素过氧化物酶，大伏革菌高的过氧化物酶活性象征着树木木质素生物降解的开始，这对于白腐菌是必要的过程。

3.3诱导寄主抗性施用大伏革菌能使寄主细胞产生有毒的代谢物质，这些代谢物质限制了异担子菌进一步生长。在植物生命活动中，细胞程序化死亡对于植物正常生理活动是很重要的，而在这一过程中半胱氨酸起着重要的调解作用。研究发现，预处理大伏革菌后，调节半胱氨酸蛋白酶产生及坏死细胞死亡的基因高度转录［36，37］，寄主部分细胞程序化死亡，从而使由异担子菌侵染引起的寄主组织坏死斑停止继续扩展［38］。最重要的是，施用腐生营养型大伏革菌后能够提高寄主的局部抗性，使寄主细胞壁木质化和栓化，强度增加，阻止了异担子菌的侵染定殖。在大伏革菌预处理过的组织中，DAHPS和SAMS两个基因高度转录，DAHPS基因可产生合成木质素过程中第一个酶［39］，而SAMA基因则编码不同木质素衍生物合成过程中的关键酶［40］。木质素及其衍生物的合成，能够阻止病原菌产生的酶和毒素的渗透和扩散，从而保护树木组织。因此，这两个基因的高度转录说明了它们在阻止异担子菌侵入的过程中的起着关键作用。

4大伏革菌防病过程对周围环境的生态影响

在森林生态系统中，根际周围存在着很多生物，如细菌、菌根真菌和昆虫等，这些生物中有的能起到保护树木的作用，它们通过营养竞争等手段来对抗木材腐朽菌。细菌在整个树木腐朽过程中非常重要，如固氮细菌对腐朽过程中氮平衡的维持起到重要作用［41］。与化学防治相比，生物防治是一种环境友好的防治方法，其对靶标生物影响较小。然而，大规模的应用生物防治剂会不可避免地对针叶树树桩上的真菌、细菌群落及地表植被造成很大的影响［42-46］。使用Rotstop处理初期，大伏革菌在树桩上占主导地位，这并不影响其他微生物定殖树桩。但是，由于大伏革菌生长速率较快，限制了其他微生物的营养利用，以致可减少达15%的物种丰富度。处理6年后，大伏革菌渐渐失去主导地位，而Resiniciumbicolor、Hypholomacapnoides和Sistotremabrinkmannii等真菌逐渐增多［46］。在意大利，施用大伏革菌2年就会对该地区真菌区系造成很大影响［47］。另外，有研究表明大伏革菌的生长能够显著降低腐朽初期阶段细菌的丰富度［43］。而应用单一基因型的Rotstop生物制剂在短时间内不会对当地大伏革菌种群基因型造成威胁［48］。

5野生大伏革菌筛选过程、指标及防病注意事项

商业化生物制剂所用菌株均是从野外采集、分离，纯化，最后通过一定的试验验证而得到的防治效果最好的菌株。Rotstop制剂所用菌株是同一种异核体菌株，PGS所用菌株是从野外采集选取的近10种菌株，而IBL选取的菌株则更多。这3种商业化制剂选取的野生大伏革菌菌株均是从野外的腐朽树桩、原木或裸露的木片上采集和分离的。采集工作是一个持续的过程，我们必须不断更新和补充菌株，筛选效果最好的菌株来防治异担子菌。筛选可用于商业化的高效大伏革菌没有固定的程序，总体来说分为3个方面。（1）在MEA培养基上测量大伏革菌生长速率和拮抗异担子菌效率。实际工作中，IBL在MEA中添加了愈创木酚，测量其酚氧化酶活性；Rotstop在MEA中添加了木质素染料，测量其分解木质素的活性，这些对于筛选高效菌株都是必需的。（2）室内测量木桩上大伏革菌防治异担子菌效率。其中，IBL选择测量被异担子菌侵染后木片失重率和预处理大伏革菌然后接种异担子菌木片失重率，失重率测量同样适用于室内木桩筛选生防菌。（3）在野外伐桩上测量前面筛选过的高效大伏革菌防治异担子菌效率。PGS和IBL在松树上进行，Rotstop在云杉上进行，经过野外伐桩防治效率的检验，最终确定商品化的菌株。2011年，Anthony［23］改良了室内筛选菌株的培养基，他所用的木锯屑改良培养基是和自然介质最接近且最适合大伏革菌生长的培养基，可以用于快速筛选高生长率和拮抗作用的大伏革菌，而室内树桩筛选关键看其在树木上的生长速率。他在2012年指出，大伏革菌的两个疏水蛋白Pgh1和Pgh2在其防治异担子菌中发挥重要作用，强拮抗作用菌株在木锯屑培养基的单菌落中Pgh1高度表达，拮抗能力和两菌株接触时Pgh1、Pgh2的转录水平呈正相关［49］。所以，在筛选高效菌株时，也可以从基因水平入手，这样使结果更为准确。作者在前人研究的基础上，从别人很少研究的酶活角度入手，研究大伏革菌纤维素酶活力与其木桩拮抗率的关系，试验得出，两者在0.01水平上显著相关。纤维素酶能够降解新鲜树桩及其根部组织细胞壁纤维素结构，使真菌能够快速定殖于树桩，这是高效生防菌株所必须的，故作者认为可以将大伏革菌胞外纤维素酶活作为高效生防菌株筛选的指标之一。另外，在筛选过程中还发现大伏革菌的控制效率和其孢子悬浮液的浓度、异担子菌的孢子悬浮液浓度以及这两个菌株孢子比例密切相关［50］。1960年，Meredith［25］发现防治松树根腐病所需的异担子菌和大伏革菌孢子悬浮液浓度比例是1/10时最有效，但在防治挪威云杉时，比例为1/2.5，每种寄主要求的比例不一样。而且防治效率和喷洒的大伏革菌孢子悬浮液的面积成一定数量关系，大伏革菌喷洒面积越大，异担子菌侵染树桩面积越小［51］。Dumas［52］在2011年得出，一些化学物质，如木质素磺酸铵（木铵，ALS）能够刺激大伏革菌的萌发和生长，当大伏革菌孢子溶解于1%或2.5%的木铵溶液时，大伏革菌在任何温度下的萌发率均比溶解于水中高，且其萌发管更长，将此悬浮液喷洒于伐桩表面时，大伏革菌能够更快定殖于伐桩表面，进而防止异担子菌侵染伐桩。大伏革菌是一种有两极杂交系统的异核体真菌，通过配对实验和DNA印迹分析得出，欧洲的大伏革菌菌株之间是互交可育的，而且其欧洲种群和北美洲种群间也是互交可育的。因此，也可以通过优良菌种杂交来达到提高大伏革菌防治效率的目的［24］。

6结语

大伏革菌菌株作为防治针叶树根腐病的有效菌株已经被广泛使用。但随着野外防治时间增加，大伏革菌优良基因退化，且病原菌形成一定的抗性。此时，使用新的筛选方案对于大伏革菌的广泛应用具有一定的好处。随着分子生物学、转录组学及基因组学等相关技术的发展，我们可以将研究目光聚焦在与大伏革菌自身拮抗能力相关的基因及拮抗异担子菌过程中相关基因转录水平的变化上，利用分子育种技术培育高效大伏革菌。

作者：李杏春何双辉单位：北京林业大学微生物研究所