基因克隆及生物信息学分析范文

《基因组学与应用生物学杂志》2015年第四期

1结果与分析

1.1小桐子JcMSRA基因全长cDNA的克隆以小桐子叶片材料提取总RNA，并反转录cDNA为模板，扩增JcMSRA基因cDNA全长序列。结果表明，扩增得到的产物约0.9kb(图1A)。将目的条带切胶回收后与T/A克隆载体pEASY-T1连接，转化大肠杆菌，菌落PCR验证阳性克隆(图1B)。挑取阳性克隆过夜摇菌，提取重组质粒pEASY-T1-JcMSRA(图1C)，并以M13通用引物进行测序。

1.2小桐子JcMSRA基因的生物信息学分析经测序分析，本研究克隆的小桐子JcMSRA基因的cDNA序列全长879bp，包含一个完整的开放阅读框(780bp)，编码259个氨基酸(图2)。通过将JcMSRA编码框与其基因组序列(Jcr4S03665,14648~16350位,1702bp)比对，发现JcMSRA基因包含2个外显子(长度分别为528bp与252bp)与1个内含子，且内含子的序列(924bp)较2个外显子都长，符合AT/GT的剪切规则。ProtParam分析结果显示，JcMSRA编码的蛋白质分子量为29.1kD，理论等电点为8.75，且单体亚基不稳定，说明其属于多聚体蛋白质。另外，该蛋白质N端不含信号肽，预测其亚细胞定位可能性最大的为线粒体、其次为细胞核。ExPASy的COILS预测发现，该蛋白质在190~220位有一个明显的卷曲螺旋区域(图3A)。作为一种超二级结构，卷曲螺旋一般由2~7个短的琢-螺旋组成，是许多转录因子与功能蛋白质的结构元件，该卷曲螺旋出现的位置正好是其二级结构中琢-螺旋最长的部位，与SOPM服务器预测的结构吻合(图3B)。分别以大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Sa-ccharomycescerevisiae)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、蒺藜苜蓿(Medicatruncatula)、毛果杨(Populustrichocarpa)、家鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)与小桐子MSRA氨基酸序列进行多重序列比对(图4)，发现MSRA氨基酸序列在N端与C端都没有同源性，差异变化较大，而在中部相对保守。MSRA属于单结构域蛋白，位于该酶蛋白活性中心的核心氨基酸残基为Phe102、Trp103、Tyr132、Glu144、Tyr184(图4,菱形标注)，而-GCF-W-保守序列的Cys与C端的两个保守Cys残基主要起维持酶活性中心结构的功能。将小桐子MSRA氨基酸序列进一步与MSR家族的三类不同(MSRA,MSRB,fRMSR)的MSR氨基酸序列进行多重序列比对，并构建系统进化树(图5)。由图中可以看出，不同的MSR被聚类为明显的三条分支，印证了MSR三个家族在氨基酸一级序列及高级结构等方面的进化差异性。我们得到的小桐子MSR被归入了MSRA分支中，与小桐子的近科物种毛果杨(Populustrichocarpa)在进化上距离较远，序列相似性仅为22.19%，而与芸豆(Phaseolusvulgaris)、棉花(ssypiumbarbadense)、油菜(Brassicanapus)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)的亲缘关系较近，序列相似性分别为70.30%、68.82%、61.65%、60%。目前，通过X-晶体射线衍射法已经获得了几种(如大肠杆菌,毛果杨,牛)MSRA的高分辨率三维结构。我们通过同源建模方法构建了小桐子MSRA的三维空间结构并进行了氨基酸残基能量评估(图6)。综合研究MSRA的晶体结构显示，其表面都有一个口袋状结构，且该结构周围的氨基酸残基相对保守，后被证实是底物甲硫氨酸亚砜的结合位点。小桐子MSRA蛋白的底物结合位点氨基酸构成为Tyr132、Glu144、Tyr184，另外，-GCFW-保守序列中的最后两位氨基酸Phe102、Trp103也参与了催化中心的形成(图6A)，而-GCFW-保守序列结构域中的Cys101以及C端的保守Cys251、Cys257在维持结合位点空间结构方面也是不可或缺的。Ramachandram能量图分析显示有96.9%的氨基酸残基处于能量稳定区域，说明预测的三维结构可信(图6B)。小桐子MSRA空间结构核心区域是3段琢-螺旋包裹的6条茁-折叠片层结构，呈现琢/茁卷状，二级结构组成顺序以茁1-琢1-茁2-茁3-琢2-茁4-琢3-茁5-茁6排列，并且茁1与茁6较短，而核心4条茁-折叠较长，在拓扑结构上排列为反平行方式。另外，在茁2与茁3之间有1段极短的琢-螺旋，在琢2与茁4之间存在2条反平行的极短茁-折叠与1段极短琢-螺旋，而在靠近N末端还存在1段极短琢-螺旋，C端存在2段极短琢-螺旋。蛋白质核心区域被两端柔性区包裹，包括N端的92个氨基酸残基(Met1-Glu92)与C端的33个氨基酸残基(Ala227-Gly259)。

2讨论

甲硫氨酸亚砜还原酶作为生物体内的抗氧化修复因子属于多基因家族，目前已经报道的甲硫氨酸亚砜还原酶有三个亚家族，不同家族虽然催化相似的反应，但没有一级氨基酸序列及三维结构相似性(Rouhieretal.,2006)。最早被报道的两个亚家族是MSRA与MSRB，MSRA与MSRB能够分别特异性地还原Met-S-SO与Met-R-SO，且两者既可以催化游离的甲硫氨酸亚砜，也可以催化蛋白表面的甲硫氨酸亚砜。第三个MSR家族最早在大肠杆菌中发现，命名为fRMSR(freemethionine-R-sulfoxidereductase)，而该酶只能催化游离的甲硫氨酸亚砜。MSRA最早从大肠杆菌中分离出来的，是一类相对较小的胞质酶，编码该酶蛋白的基因广泛存在于生物界，如梭状芽孢菌(Clostridiumsp.Ohilas)、金属还原菌(Shewanellaoneidensis)、嗜热古生菌(T.kod-akaraensis)、酵母菌、拟南芥、杨树、果蝇、小鼠、大鼠及人。该亚家族不同种属间同源性不高，但其催化部位的氨基酸序列是非常保守的。在N端存在一个保守序列-GCFWG-(尤其是中心的Cys)，这一序列的突变将导致MSRA完全失活；另外，在C端存在两个保守的还原型Cys残基，以上三个保守的Cys在空间结构上共同参与MSRA催化中心的构成(Rouhieretal.,2007)。MSRB最初也是从大肠杆菌中发现的，且在黄单孢菌(Xanthomonascampestris)、梭状芽孢菌(Clostriidiumsp.Ohila)、拟南芥、烟草、果蝇及人等生物体中都存在，属多基因亚家族，在不同生物体(如人,小鼠等)中一般都有3个MSRB，主要定位于内质网与线粒体，其N端定位信号肽在不同的MSRB中较为保守。MSRB在其N端同样存在-GCGWP-保守序列，除此之外，大部分MSRB在其C端仅存在一个保守的Cys残基(Dingetal.,2007)。与MSRA不同，MSRB中还包含两个-CXXC-保守序列，用于结合Zn2+或Fe2+，共同构成MSRB的活性中心(Olryetal.,2005)。

目前关于MSRA与MSRB的表达、调控及作用机理的研究主要集中在微生物及动物中，如大肠杆菌、酵母菌、小鼠及人等，而对于植物MSR的研究报道近几年才逐渐增多，本研究中克隆的小桐子MSRA基因也是首次报道。研究发现，拟南芥中至少存在5个编码不同形式的MSRA基因AtMSRA1-At-MSRA5，同时存在至少9个MSRB基因AtMSRB1-AtMSRB9；另外，在毛白杨中发现9个MSR基因，包括5个MSRA与4个MSRB；在水稻中发现4个MSRA与3个MSRB基因。利用在线软件预测发现，不同的MSR在植物细胞中有不同的定位，目前发现的包括细胞质、叶绿体、线粒体、内质网及分泌型MSR等(Rouhieretal.,2007)。芯片数据与转录组数据都表明不同亚细胞定位的MSR有着不同的组织表达模式，胞质型MSR通常在所有组织器官中都有表达，叶绿体型MSR主要在绿色组织尤其是叶中表达。Romero等(2004)通过RT-PCR分析了拟南芥不同MSR类型的组织表达特异性，结果表明，AtMRA4在除根以外的所有组织中的表达量都很丰富，其总表达量在所有MSRA中也是最高的；AtMSRA2和AtMSRA3表达量仅次于AtMSRA4，且主要在根和茎中表达；而AtMSRA1和AtMSRA5在所有组织中的表达量都很少；AtMSRB2、AtMSRB6的表达量在叶和其它绿色部位中最高，而AtMSRB5、AtMSRB7、AtMS-RB8、AtMSRB9则主要在根中高表达。大量数据表明，各种生物与非生物胁迫可以诱导高等植物不同MSR基因的表达，强光与盐胁迫可以强烈诱导拟南芥质体型AtMSRA4的表达(Gustavssonetal.,2002)。定位在内质网中的AtMSRB3可清除在植物受冷胁迫时内质网中积累的MetSO和ROS，过表达AtMSR-B3可以提高拟南芥植株的耐寒性(Kwonetal.,2007)。而水稻OsMSRB1.1在受到包括盐、甘露醇、低温、甲基紫精和ABA在内的非生物胁迫时表达量上升，而高温处理则会使OsMSRB1.1表达量下降(Guoetal.,2009)。以上事实说明MSR基因表达种类的多样性与组织特异性、表达调控的复杂性以及与植物应答逆境胁迫的关联性，同时也暗示其在植物抗逆性研究中的应用前景。

3材料与方法

3.1实验材料及处理供试小桐子种子采自云南省楚雄州元谋县。选取饱满的小桐子种子，用1.5%CuSO4消毒20min，无菌水漂洗5次，于26℃的恒温培养箱中吸涨24h(李忠光和龚明,2010)。将吸涨的种子在无菌水中漂洗3次，播于垫有5层用无菌水湿润滤纸的白磁盘(24cm伊16cm)中，于相对湿度75%、昼夜温度26/20℃、光周期16/8h的恒温培养箱中萌发5d。之后将发芽的种子播于消毒的培养土中并于同样恒温培养箱中培养15d至第二片真叶展开。取第二片真叶材料，液氮速冻后置于-80℃冰箱中用于RNA的提取。

3.2菌株与主要试剂大肠杆菌Trans1-T1(DH5琢)菌株由本实验室保存；TransZolUp、DNase玉、TransStartTaqDNAPoly-merase、Amp、X-gal、IPTG、2伊EasyTaqPCRSuperMix(+dye)、TransScriptTwo-StepRT-PCRSuperMix、EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPurePlasmidMin-iPrepKit、pEASY-T1CloningKit、Trans2KPlus域DNAMarker购自全式金生物技术有限公司；引物合成和测序由深圳华大基因有限公司完成。

3.3实验方法

3.3.1总RNA的提取及cDNA第一链的合成取0.2g小桐子叶片材料，按照王海波等(2014)的方法利用TransZolUp试剂提取并纯化总RNA。以AnchedOli(dT)18为逆转录引物，利用TransScriptTwo-StepRT-PCRSuperMix合成第一链cDNA。

3.3.2小桐子JcMSRA基因全长cDNA的克隆以拟南芥MSRA全长mRNA序列(XM_002510-827.1)为种子序列，对我们高通量测序得到的小桐子低温锻炼转录组(GenBank登录号:GAHK00000000.1)的45251条Unigenes进行本地Blast，得到小桐子MSRA基因的序列Unigene850_JC-CK_1A(GAHK0-1013398,1714bp)。序列分析表明其包含全长F(780bp)。以此序列为基础设计全长cDNA克隆引物，并送深圳华大基因合成。引物序列为：上游F(5''''-ACACAACTTAACTCAACACGTCA-3'''')；下游R(5''''-AACCCAGCAAACTGTATAAAAAC-3'''')。以3.3.1中反转录cDNA模板，使用TransStartTaqDNAPolymerase进行PCR扩增，扩增条件为：94℃5min寅[94℃30s,54.9℃30s,72℃1min]35寅72℃20min。扩增完成后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用EasyPureQuickGelExtractionKit从琼脂糖凝胶中回收目的基因片段(879bp)，并与克隆载体pEASY-T1连接，转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，涂LB抗性平板(LB-Amp垣IPTG垣X-gal)，过夜生长，挑取白斑菌落进行菌落PCR鉴定。阳性克隆取名为pEASY-T1-JcMSRA，并送深圳华大公司利用pEASY-T1质粒上的M13F与M13R通用引物进行双向测序。

3.3.3小桐子JcMSRA基因的生物信息学分析利用Spidey软件进行克隆cDNA序列与基因组序列比对以确定JcMSRA基因内含子与外显子的结构。利用BioEdit软件将JcMSRAcDNA序列翻译成氨基酸序列，利用在线工具ProtParam计算蛋白质的理论分子量、等电点等基本参数。利用WolfSpt在线软件对蛋白质进行亚细胞定位预测，并利用SignalP3.0Server分析蛋白质信号肽序列，接着利用在线工具TMHMM与Proscale检测其跨膜结构与亲水/疏水特性。分别利用SOPM与ExPASy的COILS软件分析其二级结构与卷曲螺旋结构。利用NCBICDD工具进行结构域与功能元件的鉴定。从Gen-Bank下载其它物种MSR氨基酸序列，利用ClustalX进行序列相似性比对，然后用MEGA4.0软件通过邻接法构建系统进化树，并采用泊松法进行检验。利用Phyre2进行蛋白质三维结构的同源建模，利用VMD软件显示其三维空间结构，并结合Ramachandram图验证模型的准确性。

作者：王海波邹竹荣龚明单位：云南师范大学生命科学学院,生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室曲靖师范学院生物资源与环境科学学院