哺乳动物卵母细胞冷冻保存效果范文

《基因组学与应用生物学杂志》2015年第四期

1卵丘细胞层对冷冻保存效果的影响

与卵母细胞相连的卵丘细胞是影响玻璃化冷冻效果的另一重要因素，关于卵丘细胞对卵母细胞冷冻效果的影响却出现不同的研究结果。部分研究者猜测卵丘细胞层及其中的糖蛋白减缓了冷冻保护剂渗透速率，导致细胞内冷冻保护剂分布不均，从而未能达到冷冻保护作用(Mahmoudetal.,2010)。同时前人的研究也证实，水牛卵母细胞在冷冻前去除卵丘细胞，可起到很好的冷冻效果(Gasparrinietal.,2007)。卵丘细胞的去除增加MPF的活性、加速卵母细胞过渡到中期阶段以及皮质颗粒的再分配(Zhouetal.,2010)。Bogliolo等(2007)报道，未成熟的绵羊卵母细胞玻璃化冷冻时，除去卵丘细胞层后，其存活率明显高于带有卵丘细胞层的卵母细胞，而进行体外成熟时发现两组的纺锤体和染色体的正常分布率差异不大。但是当裸露的卵母细胞进行冷冻后，由于受精时缺少卵丘细胞，使得胚胎发育能力下降(Zhouetal.,2010)。体外成熟前或玻璃化冷冻前，卵丘细胞层的去除将对马(Tharasanitetal.,2009)、鼠(Suoetal.,2009)和牛(Modinaetal.,2009)成熟或未成熟卵母细胞的形态均产生不利影响。小鼠未成熟卵母细胞进行玻璃化冷冻时必须保存包围在其中的致密卵丘细胞层(Purohitetal.,2012)，附有卵丘层的牛卵母细胞发育能力高于裸卵细胞，马卵母细胞体外成熟前或玻璃化冷冻前除去卵丘细胞层导致了减数分裂能力、纺锤体和染色质正常率下降(Tharasanitetal.,2009)。这可能与紧凑的卵丘细胞可阻止高毒冷冻保护剂的渗透以及在卵母细胞进行解冻时防止细胞内渗透压的升高有关，使细胞的膨胀得以控制。

2卵母细胞发育阶段对冷冻保存效果的影响

研究者进行了多次研究以确定适合卵母细胞玻璃化冷冻的最佳发阶段，然而得到的结果是不确定的。卵母细胞成熟阶段中的GV期(Wuetal.,2013)、GVBD期(Barnesetal.,1997)和M域期(Moetal.,2014)被认为是最有利进行玻璃化冷冻的阶段。但也有一些研究与此相反，即减数分裂阶段不影响冷冻保存后卵母细胞的发育能力(LeGalandMassip,1999;Hurttetal.,2000)。普遍认为，成熟的卵母细胞富含细胞器，如纺锤体和染色体，而这些细胞器对低温极其敏感，冷冻易造成这些细胞器的损伤。GV期的卵母细胞核被膜包被，此外也无纺锤体的形成，理论上是进行冷冻的最佳时期，但是冻融后细胞的超微结构损伤严重，卵丘细胞层脱离，使得后续发育能力严重下降。在小鼠卵母细胞方面，Sehrleder等(1990)则发现了冷冻M域期的卵母细胞，冻融后细胞的形态正常率高达81%，2-细胞发育率为17%，比GV期卵母细胞具有更好的冷冻效果。此外，Mo等(2014)报道，在冷冻绵羊卵母细胞方面，与M域期卵母细胞相比，GV期卵母细胞对冷冻更为敏感。在水牛方面，Sharma和Loganathasamy(2007)报道，冷冻保存M域期卵母细胞，其后续发育潜能高于冷冻GV期的卵母细胞。冻融后发育潜能的降低主要归因于卵母细胞自身的损伤，而受精失败只是其中的一小部分原因。相比之下，Barnes等(1997)表明，卵母细胞在减数分裂的胚泡破裂阶段进行冷冻保存，解冻复苏后进行成熟培养，其后续胚胎的卵裂率和囊胚率高于GV期和M域期的。他们认为选择中间阶段的卵母细胞进行冷冻保存，可以规避一些与低温保存相关的问题。Otoi等(1995)报道称在慢速冷冻中成熟卵母细胞的抗冻能力比未成熟卵母细胞强，随后在体外培养到达囊胚阶段的概率大于卵母细胞在成熟早期阶段的冷冻。然而，当添加了蔗糖作为冷冻保护剂，未成熟的卵母细胞冷冻保存后通过体外受精，卵裂率比冻融后M域期的高。这些结果表明，不同减数分裂阶段卵母细胞冷冻保存效果的差异可能来自于冷冻保护剂类型的影响。

3冷冻保护剂的类型对冷冻保存效果的影响

细胞冷冻时添加冷冻保护剂可以促进细胞脱水，避免胞内冰晶的形成，更高程度提高卵母细胞冻融后的存活率。当哺乳动物细胞处于普通盐溶液进行冷冻时，细胞将不可避免的受到损坏。然而，研究者偶然发现，当家禽精子处于10%甘油和白蛋白所组成的溶液时，冻融后精子仍存活，使用冻融后的精子进行人工受精，可以产生后代(Polge,1952;Schieweetal.,1991)，这是第一个详细报道了哺乳动物细胞经过冷冻保护剂的处理后，可以成功进行冷冻保存。自从首次发现以来，研究人员通过不断的试验，发现许多低分子量保护剂使细胞免受冷冻伤害，这些化合物统称为冷冻保护剂。目前，冷冻保护剂分为两大类：膜渗透性冷冻保护剂(乙二醇,二甲基亚砜,丙二醇)和膜非渗透性冷冻保护剂(蔗糖,聚蔗糖,葡萄糖,蛋白质类,脂蛋白)。膜渗透性冷冻保护剂通过以下几种机制起作用：降低溶液的冰点，防止过高的电解质浓度对卵母细胞的伤害；与膜相互作用，冷冻时在细胞膜表面形成一层玻璃样状；替代细胞内的水份，防止胞内冰晶的形成(Polge,1952)。慢速冷冻所需要的冷冻保护剂浓度在1~1.5mol/L之间，毒性较小，但玻璃化冷冻要求较高的冷冻保护剂浓度(高达8mol/L)，而EG和DMSO因其分子量较小而常被作为渗透性保护剂(Somfaietal.,2013)。膜非渗透性冷冻保护剂通过增加溶质的浓度产生跨细胞膜渗透梯度，作为细胞外液抗冻保护剂，不能渗透到细胞内部。将糖类添加到玻璃化冷冻液可以提高溶液粘度，即细胞在冷冻前用含有糖类的冷冻保护液进行处理，有利于细胞内水分的渗出，同时减少细胞在保护剂的暴露时间，降低细胞毒性(iefetal.,2005)，并且一些膜非渗透性冷的保护剂在细胞冷冻期间能够稳定细胞膜。通过使用两种或两种以上不同种类的混合物或多步平衡(两步或两步以上)可减少溶质损伤。目前，研究者常联合使用两种类型的冷冻保护剂进行卵母细胞的冷冻保存。据报道，相比于使用单一的冷冻保护剂，两种以上的混合物冷冻保护剂更有利于卵母细胞的冷冻保存(Chianetal.,2004;Guptaetal.,2007)。二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇和甘油通过不同的组合常用于哺乳动物卵母细胞和胚胎的玻璃化冷冻中(Moussaetal.,2014)。几项研究表明，EG是理想的冷冻保护剂，因为它渗透入膜的速度快于其它冷冻保护剂，从而降低了对细胞的毒性(Somfaietal.,2014)。在实际操作中，应当根据物种类型，选择最佳保护剂组合和作用浓度，将其不利影响最小化。

4冷冻保护剂的暴露时间对冷冻保存效果的影响

玻璃化冷冻所需冷冻保护剂的浓度很高，很容易对细胞产生毒性(Sanchez-Partidaetal.,2011)。因此，不同种类冷冻保护剂的浓度和暴露时间对冻融后卵母细胞的存活至关重要。目前有两种方法可将这些不良影响降到最低：一是在置于低浓度的冷冻保护剂溶液平衡之前，使卵母细胞短暂接触含有高浓度冷冻保护剂的玻璃化溶液；二是在确保冷冻保护液渗入细胞时，尽可能缩短曝露于冷冻液的时间(Konoetal.,1991;Woodetal.,1993)。暴露于冷冻保护剂的时间主要取决于它们渗透到卵母细胞或胚胎的速度，如EG由于分子量小，渗透率比甘油、DMSO和PG高。Mahmoud等(2010)报道称将卵母细胞分别暴露于二甲亚砜、乙二醇和甘油中，随后通过形态学检查显示，未成熟的水牛卵母细胞的存活率并没有差异。在这方面，Wood等(1993)也报道了小鼠和仓鼠的卵母细胞暴露在1.5mol/LDMSO3~5min，复苏后大部分形态恢复正常。但在这实验中，水牛卵母细胞成熟率却严重受到影响，其中在DMSO组最严重，其次是甘油和EG组。Martins等(2005)报道，牛未成熟的卵母细胞在40%的EG中平衡时间长达5~15min，严重降低了卵母细胞的成熟率。这表明在选择不同种类的冷冻保护剂时，暴露时间是一个非常重要的参数，最佳暴露时间可降低细胞毒性以及防止胞内冰晶的形成。

5冷冻载体的类型对冷冻保存效果的影响

1995年，Han等(1995)研究结果表明载体所盛的溶液体积与冷冻速度密切相关，减少载体所带的液体，能提高冷冻降温速度。体内外生产的胚胎和卵母细胞进行玻璃化冷冻时使用合适的冷冻载体进行冷冻保存，能加快冷冻与解冻速率，提高冷冻保存效率。迄今为止，使用冷冻帽法(cryotop)、开放式拉长塑料塑管法(pulledstraw,OPS)、冷冻环法(cryoloop)、玻璃微细管法(glassmicropipette,GMP)、金属表面积法(solid-surfacevitrification,SSV)等冷冻载体保存人、山羊、牛、鼠及马的卵母细胞或胚胎时均有获得成功的报道。近十余年来，卵母细胞的玻璃化冷冻中，OPS和Cryotop方法常被广泛使用(Jim佴nez-Trigosetal.,2013;Alietal.,2014)。在卵母细胞和胚胎的玻璃化冷冻中，合适的冷冻载体能够使细胞快速越过危险温区，降低冷冻损伤程度。Subramaniam等(1990)研究表明，解冻时将冷冻管在空气停留几秒对于防止透明带断裂至关重要的。但是Cetin和Bastan(2006)研究发现将冷冻管在空气中停留5s，透明带依旧有破裂的现象，这可能是由冷冻载体在解冻时影响到解冻速率，未能越过冰晶的临界温度。此外，Lim等(1991)研究观察到卵母细胞玻璃化冷冻后的存活率会因为冷冻载体的不同而出现差异，所以推测可通过对冷冻载体进行改善而获得更好的冷冻效果。为了提高玻璃化的冷冻与解冻速度，有必要通过选择更合适的冷冻载体尽可能减少所带玻璃化溶液的体积，提高冷冻保存的效果。

6结语

低温生物学因其在胚胎生物技术和辅助生殖技术方面有着广阔的应用前景，受到了极大的关注。目前，玻璃化冷冻技术已广泛应用于多种哺乳动物卵母细胞的冷冻保存，然而由于卵母细胞自身的特点，造成玻璃化冷冻技术的应用存在许多问题，主要表现为冻融后细胞结构的改变和后续发育能力降低。影响卵母细胞玻璃化冷冻效果的因素是多方面的，很难由一方面的改进而使冷冻效果发生较大的变化。近年来平衡时间的优化、加快降温速率和解冻程序的改善也成了研究卵母细胞冷冻的关注点，而具体的效果有待在研究中不断的摸索。因此，在卵母细胞玻璃化冷冻技术的改良上，还需要进行多方面的研究。

作者：王彩玲张华智王利彭三凤周学亮陆阳清杨小淦许惠艳卢晟盛卢克焕单位：广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 广西高校动物繁殖与动物生物技术重点实验室钦州市畜牧站,