烟草烟碱代谢的生化和分子机制范文

《基因组学与应用生物学杂志》2015年第四期

1烟碱代谢途径

1.1吡啶环的形成对于吡啶环用于合成烟碱的直接底物目前尚无定论。体内放射性同位素标记实验证实，烟酸先还原为3,6二氢烟酸(Leete,1980)，至于后者如何脱羧、如何与吡啶环缩合、是否有中间物质的参与等问题仍不得而知。吡啶核苷酸途径起始于L-天冬氨酸，其在天冬氨酸氧化酶(partateoxide,AO)作用下氧化形成琢-亚氨基琥珀酸(Katohetal.,2006)。紧接着，3-磷酸甘油醛与琢-亚氨基琥珀酸在喹啉酸合成酶(quinolinatesynthe,QS)催化下凝结形成喹啉酸(Ka-tohetal.,2006)。在许多细菌，包括大肠杆菌中已发现了AO和QS的存在，但烟草中还未见报道。给烟草喂食[3-14C]p后，在吡啶环的C-2和C-3位置能检测到放射性(JackaniczandByerrum,1966)。烟碱吡啶环是烟草和相关物种NAD生物合成的中间产物(WallerandHenderson,1961)。拟南芥基因组数据库搜索结果显示，At5g14760编码的蛋白与E.coli的AO有42%的同源性，At5g50210编码的蛋白与E.coli的QS有24%的同源性。为了验证At5g14760和At5g50210是否分别编码AO和QS，Katoh等(2006)利用缺失表达AO和QS的nadB-和nadA-E.coli菌株进行了实验。当nadB-中有At5g14760表达时，E.coli能形成烟酸，当nadA-中有At5g50210表达时，E.coli也能形成烟酸。这一结果表明，At5g14760和At5g50210分别编码了AO和QS。生物信息学预测拟南芥AO和QS定位于质体中，Katoh等(2006)实验证实其地位于叶绿体中。胚胎发育时期，AO或QS的无义突变均是致死的，这表明AO和QS对细胞代谢至关重要(Katohetal.,2006)。喹啉酸在喹啉酸磷酸核糖基转移酶(quinolinicacidphosphoribosyltransfere,QPT)的催化作用下形成烟酸单核苷酸(NAMN)，以此进入吡啶核苷酸循环，进而形成烟酸。与PMT在甲基吡咯烷途径的关键作用类似，前期的许多研究表明，QPT是烟碱生物合成的分支途径吡啶核苷酸循环的限速步骤(Wagneretal.,1986)。Conkling等(1990)利用差异杂交技术首先从烟草中分离出了根特异性的QPT，当时命名为TobRD2，之后重新命名为NtQPT1。Sinclair等(2000)通过筛选N.tabacum根的cDNA文库真正的分离鉴定出了NtQPT1。在这两项研究中，QPT的功能都是基于其序列与其它物种QPT序列的相似性推断出来的，然后在QPT缺失的E.coli突变株中进行功能互补试验来证实。QPT活性研究表明，NtQPT1的表达在aabb中显著降低，打顶和机械刺激使之上调表达，受植物生长素抑制(Sinclairetal.,2000)。以往的研究表明，QPT的活性调节与PMT十分相似，但PMT仅参与生物碱合成，而QPT则对于出生代谢也很重要，作为进入吡啶核苷酸循环的起点，形成重要的辅因子NAD。Shoji和Hhimoto(2011)发现，烟草基因组中存在两个密切相关的QPT。QPT1在所有组织中本底表达，在顶端分生组织中表达略强，可能与NAD的产生有关，QPT1对于调节烟碱合成的遗传、生物、非生物因子无应答。QPT2即NtQPT1，其仅在根组织中强烈表达，并与其它参与烟碱生物合成的结构基因协同调控。由于QPT参与初生代谢，所以QPT下调并不能作为降低烟草中烟碱含量的首先方案。

1.2吡啶环和吡咯环的结合PIP家族异类黄酮还原酶类蛋白A622和小檗碱桥连酶类蛋白NtBBL是烟碱成环所必需的(De-Boeretal.,2009;Kajikawaetal.,2009)。然而，两个环如何连接形成烟碱仍未弄清楚。A622为一个异类黄酮还原酶基因，是利用消减杂交技术随PMT一起得到分离的(Hibietal.,1994)。研究证实A622与PMT和其它烟碱代谢基因具有十分相似的表达模式(Caneetal.,2005)，但一直缺乏说明A622参与烟碱生物合成的证据。2009年的两个报道补充了这一点。N.glauca(叶片中以假木贼碱为主要生物碱,并有少量的烟碱和新烟碱)的A622-RNAi株系，三种生物碱含量急剧下降(DeBoeretal.,2009)。Kajikawa等(2009)利用RNAi技术在烟草BY-2细胞和转基因植物的根毛区均抑制了A622的表达。MeJA处理的BY-2细胞，A622抑制后新烟碱水平降至对照的10%以下，同时其它生物碱含量也有相似的下降(Kajikawaetal.,2009)。有趣的是，无论是转基因植物还是BY-2细胞中，A622-RNAi引起的生物碱含量下降，都伴随着烟酸茁-N-葡萄糖苷(NaNG)的积累，而NaNG被认为是烟酸的脱毒产物。野生型烟草的根毛区以高浓度烟酸处理，也引起了生长抑制和NaNG积累，表型上也与上述RNAi植株经茁-雌二醇诱导后十分相似(Kajikawaetal.,2009)。尽管已证实A622参与吡啶生物碱的合成，但该基因编码的酶活性尚不清楚。A622酶与PBE还原酶有极高的序列一致性，但A622重组蛋白无催化此反应的能力(Shojietal.,2002)。A622能特异性结合NADPH，能催化NADPH依赖的氧化还原反应。A622-RNAi的毛状根中NaNG和N-甲基吡咯啉阳离子都有积累，这证实了A622的功能，A622参与所有生物碱合成所需的烟酸衍生物前体的形成，同时参与吡啶环和吡咯环的缩合反应(Kajikawaetal.,2009)。烟碱生物合成研究的最新突破在于BBL的发现和鉴定，BBL蛋白参与烟碱形成的最后阶段。与烟碱代谢途径的其它基因一样，BBL也是一个小基因家族，至少有4个亚型，在aabb植株中其表达下降(Kajikawaetal.,2011)。BBL-RNAi植株叶片烟碱含量降至对照的10%。经MeJA诱导的BY-2细胞BBL-RNAi，所有的吡啶生物碱含量几乎检测不到。与A622相似，BBL的酶活性尚未得到确认，但这些蛋白定位在液泡，可能具有FAD-依赖型氧化还原酶功能，影响烟草所有的吡啶生物碱的合成。对BBL抑制型转基因植株中特殊代谢物的检测表明，BBL在烟碱合成的后期，很可能是最后阶段起作用。不论是在转基因毛状根中诱导型抑制BBL，还是在转基因植物中组成型下调BBL表达，均引起一种特殊代谢物二氢异位烟碱(DMN)的积累(Kajikawaetal.,2011)。DMN是一条直链N-甲胺基，其C-3位置上有一个吡啶环。DMN的积累仅在根部，说明那些负责生物碱转运至叶片的分子转运体并不识别DMN。据此推测，BBL的作用阶段在吡啶环和N-甲基-吡咯环起始缩合之后。利用重组BBL的酵母实验研究是否BBL的真正作用是DMN-烟碱的氧化，得到了否定的结果，但是酵母的翻译和转录后加工毕竟不同于烟草(Kajikawaetal.,2011)。尽管BBL催化的酶促反应本质还有一些问题没有解决，但是它们的发现有助于我们对生物碱合成的最后阶段的理解。

2烟碱转化

烟碱可在烟碱去甲基化酶作用下形成降烟碱。通常降烟碱仅占吡啶生物碱总量的2%~4%，但遗传上的不稳定性导致在种群中自发产生高降烟碱含量的转化植株，成为烟草产业的一大难题。长久以来，已进行了大量尝试，通过杂交和培育以尽量减少转化植株的出现。最初强调维持低降烟碱水平主要为了避免不好的气味和香气特征的出现。然而，后来发现降烟碱是NNN(N-硝基-降烟碱)的直接前体，NNN是烟草制品中一种主要的强致癌物。降烟碱是通过烟碱N-甲基化作用形成的，烟碱去甲基化酶催化降烟碱产生的一个重要特征是，这一反应优先发生于叶片中，而不是根中，并且在成熟叶片和烘烤过程中活性较高(Wada,1956)。随后的酶学研究显示，烟碱去基化是一个氧化过程而非转甲基反应，催化这一反应的酶表现出细胞色素P450家族的单氧化酶的典型特征(Chelvarajanetal.,1993;HaoandYeoman,1998)。Siminszky等(2005)利用基因芯片技术对转化和未转化的burley株系的研究表明，CYP82E4与转化植株中高降烟碱含量有关。CYP82E4的功能验证是通过在酵母微粒体中重组酶的体外分析和转基因植物中基因的抑制与过表达分析完成的(Siminszkyetal.,2005)。在CYP82E4的鉴定过程中发现，烟草基因组编码了多个与CYP82E4相似的基因，它们在核酸和氨基酸水平均有90%以上的序列一致性。CYP82E2/3/4同时被分离鉴定出来，但是在异源酵母系统和转基因植物中均无烟碱去甲基化酶(NND)活性(Siminszkyetal.,2005)。据此推测，烟草基因组至少有另一个NND基因，负责低水平的降烟碱的合成。进一步研究证实，存在两个与CYP82E4相似的基因CYP82E5v2和CYP82E10，编码有活性的NND(GavilanoandSim-inszky,2007;Lewisetal.,2010)，三个NND活性相似，但其表达谱差别很大。CYP82E4受衰老和乙烯的强烈诱导，尤其在转化植株中(Chakrabartietal.,2008)。相反CYP82E5v2或CYP82E10不受衰老诱导，且在转化和非转化植株中表达无变化。CYP82E5v2在绿色、未衰老叶片中表达，但比转化植株衰老叶片中CYP82E4的表达水平低很多(GavilanoandSiminszky,2007)。CYP82E10在转化和非转化植株中表达水平均较低，但主要是在根中表达(Lewisetal.,2010)。烟草烟碱去甲基化酶基因家族的研究得出，CYP82E5v2和CYP82E10主要负责典型的非转化植株中低水平降烟碱合成，而CYP82E4负责转化植株中降烟碱含量显著升高的部分，其直接证据为，Lewis等(2010)通过化学诱导同时敲除突变三个NND，降烟碱水平几乎接近最佳的CYP82E4-RNAi植株。烟碱和降烟碱均有S-和R-型，差别在于吡咯环的2''''-C。烟碱库的稳定主要以S-为主，R-仅占约0.2%。降烟碱库的立体异构体组成变化很大，R-可占到4%~75%(Liuetal.,2008)。对重组生物CYP82E4、CYP82E5v2和CYP82E10的底物特异性研究表明，NND对映异构体的选择性造成了降烟碱异构体组成的可变性(CaiandBush,2012)。CYP82E5v2和CYP82E10对R-有极高的底物选择性，而R-和S-都可作为CYP82E4的底物。因此，当CYP82E4表达水平很低时，降烟碱库中R-降烟碱比例较高；而CYP82E4高表达时，则以S-降烟碱为主。理解降烟碱的立体异构体组成很重要，因为S-NNN(推测来自S-降烟碱)的致癌性远高于R-NNN(Laoetal.,2007)。

3烟碱代谢的上游调控

烟碱生物合成是由激素、转录因子(TF)、蛋白激酶和其它蛋白参与的复杂调控过程。除了参与生物碱合成的重要结构基因，转录表达谱研究也有效地鉴定出了两个独立的转录因子家族，它们能有效地调节细胞中生物碱的合成。ossens等(2003)利用MeJA(茉莉酸甲酯)处理和无处理的BY-2细胞对比研究，鉴定出459个差异表达基因，其中包括一组ERF(乙烯响应因子)转录因子。为了区分真正参与生物碱合成调控的基因，他们在2005年开发出了一套高处理量的瞬时表达系统，鉴定能激活PMT启动子-荧光素酶报告基因的基因。利用这一系统从17个候选基因中筛选出NtORC1和NtJAP1这2个基因。NtORC1和NtJAP1都属于ERF超家族，是烟草基因组中最大的TF(转录因子)家族(Rushtonetal.,2008)。虽然NtJAP1过表达并未引起烟草吡啶生物碱的显著升高，但是ORC1过表达则使烟碱含量升高接近2倍(DeBoeretal.,2011b)。能够证实ERF家族转录因子调节了生物碱合成的最令人信服的证据在于，低烟碱株系Burley21(aabb)的转录组分析结果表明，与野生型相比，ERF189显著下调(Shojietal.,2010)。而除了ERF189外，至少还有6个具有很高序列相似性、同属于IX的ERF，在B位点的纯合突变株中均缺失。这些TF都特异性地与GCC-box元件结合，而该元件存在于数个参与烟碱代谢途径的结构基因的启动子区域(Shojietal.,2010;ShojiandHhimoto,2013)。另一类诱导烟碱合成的TF属于MYC2样的bHLH家族。Todd等(2010)用MeJA处理N.benthami-ana根组织，利用病毒诱导的基因沉默系统筛选差异表达基因，发现了两个紧密相关的bHLH基因，NbbHLH1和NbbHLH2，作为N.benthamina中JA(茉莉酸)诱导的生物碱合成的正调节因子。Shoji和Hhimoto(2011)在N.Tabacum中得到了相似的结果，发现了NtMYC1和NtMYC2。凝胶迁移分析结果显示，特异性结合G-box元件的转录因子，存在于烟碱代谢途径结构基因的启动子区域。MYC2样bHLH类TF可能直接调节结构基因的表达，或通过激活ERF类TF间接调节生物碱合成。转录因子的鉴定主要是基于拟南芥(Arabidopsisthaliana)进行的JA信号途径的研究。通过筛选对冠菌素不敏感的拟南芥突变体，鉴定出COI1作为JA信号通路的重要调节因子。COI1是一个F-box蛋白，作为CYP82E3泛素连接酶复合体的特异性决定因子，引导蛋白质进入26S蛋白酶体进行降解。COI1的靶蛋白之一是JAZ(一种转录抑制子,JmonateZIM-domain)蛋白，在拟南芥中JAZ通过结合MYC2抑制JA响应基因的转录。存在COI1和JA-Ile(茉莉酮酸-异亮氨酸)时，JAZ阻遏蛋白降解，MYC2激活具有G-box的JA响应基因(Memelink,2009)。对烟草中COI1和JAZ同源物的转基因研究发现，烟草中生物碱合成具有类似的调节方式(Shojietal.,2008)。此外，利用酵母双杂交系统研究烟草JAZ蛋白，表明NtMYC2/NbbHLH1蛋白之间存在互作，但NtJAZ与ERF189和ERF221之间则无互作(DeBoeretal.,2011a)。蛋白磷酸化事件也参与调解MeJA激活的烟碱合成基因。MeJA处理的BY-2细胞进行转录谱筛选获得的蛋白激酶激酶(MAPKK)参与了调节过程(ossensetal.,2003)。MeJA存在时JAM1和NbbHLH1共表达，报告基因活性升高130倍。相反地，在瞬时表达系统中加入MAPKK抑制剂，能显著减弱MeJA介导的ORC1的激活(DeBoeretal.,2011)。MAPKK蛋白磷酸化级联反应作为翻译后调节机制，通过MeJA途径活化烟碱合成基因，并且很可能作用于有ERF和bHLH转录因子参与的复合体。综上所述，在不存在JA或功能类似物(如JA-Ile)时，JAZ蛋白与MYC2/bHLH转录因子结合，它们能够阻止生物碱合成基因或B位点ERF的转录。存在JA时，通过26S蛋白酶体复合物促进了COI1对JAZ蛋白的识别和降解。当JAZ阻遏物被降解后，G-box识别的MYC2/bHLH转录因子可自由活化生物碱合成基因。MYC2/bHLH活化B位点基因导致ERF转录因子与烟碱生物合成基因启动子的GCC-box区域结合，额外刺激转录的增强。最后，JAM激活JAM1的转录或活化启动子，蛋白磷酸化级联反应进一步增强MYC2/hHLH-ERF转录起始复合体。

4烟碱的转运

近期研究致力于阐明生物碱的胞内转运和定位。2009年，两个负责生物碱转运的蛋白被发现，它们把生物碱转运至中央液泡中。NtMATE1和NtMATE2编码的蛋白具有96.4%的一致性，它们是通过野生型和aabb的根组织进行差异转录组分析得到鉴定的(Shojietal.,2009)。Nt-JAT1是通过对MeJA处理的BY-2细胞进行转录组分析得到的(ossensetal.,2003)，Morita等(2009)证实了其作为生物碱转运体的功能，属于MATE家族。NtMATE1/2和Nt-JAT1之间的相似度包括：定位于液泡膜、广泛的底物特异性(包括烟草内源性吡啶生物碱)、H+依赖的逆向转运蛋白功能、酵母中超表达会导致其错误定位至质膜，从而引起烟碱的外流。尽管它们有较多相似性，但是NtMATE1/2和Nt-JAT1蛋白只有大约35%的氨基酸序列一致性。而且，Nt-JAT1在叶片、茎和根中均有表达，而NtMATE1/2主要在根中表达(Shojietal.,2009)。总之，烟草中MATE型转运体保护细胞免受生物碱或其它阳离子的毒性损伤，将烟碱转运至液泡中贮存。近期，另一个烟碱转运体NUP1(nicotineuptakepermee1)被鉴定出来，与MATE型转运体有很多不同的特性。NUP1为质膜定位蛋白，将烟碱由质外体空间转运至胞质(Hildrethetal.,2011)。与MATE不同，NUP1对烟碱具有很高的特异性，不能转运萜类生物碱甚至新烟碱和降烟碱。虽然NUP1-RNAi转基因植株叶片和根中烟碱积累下降，但是植物根系向叶片转运烟碱的能力并未下降。当培养基中补充烟碱时，NUP1-RNAi植株根系中积累较少的烟碱，并且对于根伸长的抑制效应敏感度也较低(Hildrethetal.,2011)。Hildreth等(2011)提出，NUP1功能在于通过调节根细胞与根际环境之间烟碱的释放和重吸收，以维持烟碱水平的稳态。近年来关于烟碱转运体的研究有较大进展，但对于吡啶生物碱如何转载进入根系木质部以启动根-茎转运，目前尚未见报道。有趣的是，N.alata能够在根系合成生物碱，但不具有转运至叶片的能力。N.alata和N.langsdorffii(近缘品种,但能长距离转运生物碱)的种间嫁接和杂交实验证实，N.alata的非转运表型相对于N.langsdorffii的可转运表型为显性(Pakdeechanuanetal.,2012)。在本实验室的研究中发现，NUP的表达情况与烟碱的含量相关性较高。

5展望

烟草不仅是重要的经济作物，而且是植物研究的模式植物。因此，烟草产业和学术研究者对烟草基因组的结构和功能的理解都具有长久的兴趣。虽然烟草烟碱的合成、遗传调控、转运以及代谢途径已基本清晰，且多数代谢步骤、转运过程和调控途径都有部分基因得到了分离和鉴定，但普通烟草为多倍体植物，每个基因都有大约5个同源基因，目前尚未完全分离出来，因此，烟碱代谢功能基因的解析仍需要进行大量的研究。近年来，烟碱合成的遗传调控机制研究已经成为烟碱合成途径调控研究的热点问题，因此，烟碱代谢的遗传调控因子的分离和鉴定将是近期的主要研究内容。随着新一代测序技术和组装技术的发展，烟草全基因组的解码也获得了长足的进步，2012至2014年，了7个完整的烟草基因组序列(WangandBennetzen,2015)。因此，利用高通量测序技术获得烟草全基因组或转录组序列，将会是今后研究的重要方向。实际上烟碱生物合成调控是复杂的调控网络，生物内在因素和外界环境均可影响花青素的合成，从分子的角度看，基因表达的多种信号传递网络均可指烟碱合成的结构基因，其中的信号因子和信号传递的途径还有待于深入研究。随着分子生物学研究技术和手段的飞速发展，将逐步加速烟碱代谢调控机制的解析，为低降烟碱含量烟草分子育种提供新的保障。

作者：金云峰李军营张建波龚明单位：云南师范大学生命科学学院生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室云南省烟草农业科学研究院