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锈菌类真菌基因组结构分析

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《菌物学报》2016年第四期

摘要:

锈菌种群庞大,可以引起许多重要经济作物和林木病害,严重威胁全球粮食和林业生产安全。全基因组分析为锈菌基因功能研究、毒性变异研究及锈菌演化规律研究提供了重要基础,为制定锈病有效防控策略和创制抗锈新材料提供理论依据。本文综述了目前锈菌全基因组分析领域的进展,对锈菌的基因组结构、基因组成、基因组变异等特征进行了归纳分析,对基因组变异与其专性寄生特性的关系、基因组变异对其毒性变异的可能影响等进行了阐述。基因组学将为最终揭示锈菌生活史复杂性和毒性高度变异性的根本成因提供有力工具。

关键词

锈菌,基因组,毒性,变异,基因组测序,进化

锈菌属于担子菌门真菌,已发现130多属,5000余种,是高等专性活体寄生真菌。寄主植物被锈菌侵染后,在叶片、叶鞘、茎或果实上长出大量的橙色、褐色或者红色锈状孢子堆,有的还可在枝干上引起肿瘤、粗皮、丛枝、曲枝等症状,或造成落叶、焦梢、生长不良等。严重时孢子堆密集成片,植株因体内水分大量蒸发而迅速枯死。锈病是世界范围广泛分布的农作物和森林作物重大灾害性病害(Petersen1974;Aniksteretal.2004)。近一个世纪以来,锈病中最具代表性的小麦锈病频繁爆发流行,造成包括我国在内的全球小麦主产国毁灭性损失。研究表明,锈菌的毒性变异是导致小麦品种抗病性的“丧失”,进而造成病害大规模流行的根本原因。因此,揭示锈菌毒性变异的基础成因是解决品种抗性“丧失”,实现病害持久控制的必由之路。生物遗传变异的重要表现是其各种途径导致的基因组变异,包括基因组序列变异和结构变异。序列变异主要有单核苷多态性、短序列插入与缺失)、微卫星或简单重复序列)和转座子等类型;结构变异主要包括大片段插入与缺失、基因有/无变异和基因拷贝数变异,表现为基因组区域大范围的插入、缺失、复制、倒置(inversion)和移位(translocation)。研究表明,植物病原菌基因组水平的各类变异可以最终导致病原菌毒性变异。因此,全基因组测序分析和比较基因组分析是揭示锈菌类真菌演化规律和毒性变异分子机制的有效途径。近年来,基因组学的迅猛发展为最终揭示锈菌生活史复杂性和毒性高度变异性的根本成因提供了有力工具。本文综述了目前锈菌全基因组测序分析领域的进展,对锈菌的基因组结构、基因组成、基因组变异等特征进行了归纳分析,对基因组变异与其专性寄生特性的关系、基因组变异对其毒性变异的可能影响等进行了阐述。

1锈菌的全基因组测序分析

锈菌为专性寄生、难以在人工培养基上培养、生活史具复杂多型现象和遗传转化困难等使得锈菌的基因组学及基因功能研究发现相对滞后。在第一个植物病原真菌——水稻大角间座壳(稻瘟菌)Magnaportheoryzae基因组草图(Deanetal.2005)公布6年后,基于Sanger法测序的两个锈菌—[禾柄锈菌小麦专化型和落叶松‐杨栅锈菌]全基因组测序分析发表。随后,基于二代高通量测序技术的5个锈菌基因组草图先后发表(表1)。在锈菌基因组测序中,用于DNA提取的菌体都是相对易于收获的夏孢子——一种双核的厚壁孢子。基因组DNA序列存在高度的杂合性,杂合度是人类基因组的1.6倍(Zhengetal.2013),给锈菌基因组拼接带来严重障碍,作为基因组拼接完整性重要参数的CotigN50和ScalffoldN50均大大低于水稻大角间座壳等其他真菌基因组草图。这在基于二代测序技术的锈菌基因组拼接中更为明显,条形柄锈菌小麦专化型Pucciniastriiformisf.sp.tritici‐130基因组采用全基因组鸟枪法测序拼接,ScalffoldN50甚至只达到5.2kb(表1)。条形柄锈菌小麦专化型Pucciniastriiformisf.sp.tritici‐CY32基因组通过采用Fosmid‐to‐Fosmid二次拼接策略将这一参数提高到125kb(Zhengetal.2013)。在已公布的锈菌基因组中普遍包含相对较大数量的预测蛋白编码基因,基因数量在14445个~25288个之间(表2)。对两个小麦锈菌(Pst和Pgt)和落叶松‐杨栅锈菌(Mlp)编码蛋白基因的对比分析表明,两种小麦锈菌的同源基因有5560个,而Pst和Mlp的同源基因只有1937个,相比于Mlp、Pst和Pgt的同源关系更近。Pst、Pgt和Mlp种特异基因数分别为4469、5827和4922个。在Pst特异性的4469个基因中,只有14.43%(1066)和3.38%(250)在GO和PAMGO数据库中有已知功能的同源基因(Zhengetal.2013)。这表明在基因组水平上,锈菌物种之间的差异十分显著,这或许与其生活史的复杂性及转主侵染的适应性需求相关。

2锈菌基因组大小与锈菌演化

基因组承载着生物进化的印迹,基因组大小是物种的重要特征。基因组的大小和动态变化对物种的进化适合度、繁殖和产生多样性的非有性机制都有直接的影响(D’hondtetal.2011)。真核生物基因组的大小变化范围很大,真菌是真核生物中基因组相对较小的类群。利用流式细胞技术对1850种真菌基因组大小进行评估,发现所检测真菌平均基因组大小仅为44.2Mbp,担子菌门真菌平均基因组大小为70.4Mbp,而锈菌平均基因组大小为305.5Mbp。最近发表的鬼针草单孢锈菌基因组达到了2489Mbp,是目前已知最大的真菌基因组(Ramosetal.2015a)。锈菌和其他真菌相比明显表现出基因组增大的进化趋向,这种扩增趋势可能与其寄生专化性和繁殖复杂性(无性、有性及稀少有性)的进化需求有关。具有大的、可塑性强的基因组可能有利于锈菌在分支选择(cladeselection)中避免灭绝,在与寄主共进化中以更高的频率产生新的毒性类型偶然地扩展到新的寄主群体或新寄主。不同锈菌基因组大小差异可以达到30倍,从栎柱锈菌梭形专化型Cronartiumquercuumf.sp.fusiforme基因组大小76.6Mbp到鬼针草单孢锈菌U.bidentis基因组大小为2489Mbp。锈菌属内种间的基因组大小变动范围也明显大于其他真菌,说明基因组大小的变异可能在锈菌进化、遗传分化和寄主专化性演化中发挥活跃的作用(Ramosetal.2015b)。从已发表的植物病原真菌基因组对比结果可以看出专性活体营养型真菌如锈菌、白粉菌等基因组明显大于非专性活体营养、半活体营养和死体营养型真菌(图1)。尽管目前尚不能完整解释这一现象的成因,但通过增大基因组(转座子作用为主要动力)可以增加遗传多样性,从而减少锈菌作为活体营养的专性寄生菌在群体遗传漂移(drift)中灭绝的可能性。

3锈菌基因组的转座子和重复序列组分

锈菌类真菌基因组大小的显著膨胀主要是其转座子和重复序列成分的增加造成的,其基因数量并没有同比例显著增加。转座子成分的活性可能是锈菌群体遗传和寄生专化性(毒性)保持多样性的重要动力,这对未发现转主寄主的不完全锈菌(无性繁殖为主)可能更为重要,它们也往往保持着较大的基因组(Ramosetal.2015b)。落叶松‐杨栅锈菌和禾柄锈菌小麦专化型全基因组序列分析结果表明,其基因组中不存在大片段的重复,但是含有大量的转座子和重复序列,约占整个基因组的45%。比较不同营养型真菌基因组转座子和重复序列含量发现,与非专性活体营养真菌相比,专性活体营养锈菌类基因组转座子和重复序列含量明显更高(图2)。在不同锈菌基因组中,不同类型的转座子含量存在明显差异(图3)。在落叶松‐杨栅锈菌基因组中,Ⅱ类末端反向重复序列(TIR,14%)转座子的比例较Ⅰ类长末端重复序列反转录(LTR,8%)转座子的比例更高。与之相反,在禾柄锈菌小麦专化型基因组中Ⅱ类(TIR)转座子和Ⅰ类(LTR)转座子所占基因组的比例则分别为9.8%和12.4%。在条形柄锈菌小麦专化型基因组中Ⅰ类长末端重复序列反转录转座子(LTR)和Ⅱ类末端反向重复序列(TIR)转座子含量最高,分别占基因组的27%和17%(Zhengetal.2013)。咖啡驼孢锈菌Hemileiavastatrix的Ⅰ类长末端重复序列反转录转座子(LTR)最多,占总基因组大小的38.7%。同时在咖啡驼孢锈菌基因组中发现了四种新的Ⅰ类长末端重复序列反转录转座子(LTR)。由于基因组中大量转座子的存在造成基因组的重组,使得近源种间直系同源家族基因的共线性发生了很大的变化。目前转座子含量的差异对不同锈菌基因组以及致病性的影响还有待研究。转座子是基因组的基本组成部分,是促使基因组防御系统发展的主要推动力,并且可以多种方式对基因组的可塑性和演变作贡献。

4锈菌基因家族扩增与丢失

基因注释及比较基因组分析发现,在进化过程中锈菌基因家族出现大量的扩增或缺失,以及家族内基因数量的增加或减少。相比于拥有4583个基因家族的原始祖先,禾柄锈菌小麦专化型(Pgt)目前有5413个基因家族,有1241个基因家族的增加和411个基因家族的减少。而落叶松‐杨栅锈菌(Mlp)分别增加了909个基因家族,减少了188个基因家族,目前拥有5304个基因家族(表2)。一些膨胀的基因家族有物种特异性,可能在进化过程中这些基因对寄主专化性起重要作用。在禾柄锈菌小麦专化型(Pgt)和落叶松‐杨栅锈菌(Mlp)中,共有5045个同源基因。但是,由于扩张的转座子对基因组大量的改组,使得同源基因的共线性很低。Duplessiseta(l2011)利用silico对Mlp和Pgt基因组分泌蛋白(SP)进行基因预测和手动注释,分别鉴定出了1184和1106个SP,其中谱系特异性基因分别占74%和84%。Mlp和Pgt基因组SP基因家族的膨胀非常显著,占整个扩张基因组家族的10%(表2)。对接种叶片后表达量最高的前100个基因分析发现:落叶松‐杨栅锈菌(Mlp)和禾柄锈菌小麦专化型(Pgt)中分泌蛋白的数量分别占到50%和28%。在侵染的植物组织中大多数上调表达的SP基因是谱系特异性的,只有16%在两种锈菌中有同源基因。Zhengetal.(2013)通过比较3种锈菌(Pst、Pgt、Mlp)基因组成分发现,条形柄锈菌小麦专化型特异的基因中多数已知功能的基因类型属于转运蛋白,激酶、碳水化合物激活酶类和分泌蛋白(SPs),其中分泌蛋白所占比例最高。表明这些分泌蛋白基因进化速率很高,保守性很低,可能在毒性变异中发挥着重要作用(图4)。

Nemrieta(l2014)通过对4种锈菌(Pst、Pgt、Mlp、Mli)基因组候选分泌蛋白家族预测发现,编码几丁质酶的家族总共有61个成员,其中32个是分泌蛋白。这表明一些效应蛋白可能从一些非分泌原始祖先进化而来,从而在真菌细胞壁以外的寄主细胞壁或者在寄主细胞内部执行相似的生物学功能。对已知的亚麻栅锈菌无毒基因、蚕豆锈菌效应蛋白、以及玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)效应蛋白分支酸变位酶1进行生物信息学分析,在(Pst、Pgt、Mlp)中也未发现同源基因,或者同源基因不具有无毒基因特性(Persoonsetal.2014)。这表明分泌蛋白基因家族具有较高的进化速率以及较低的保守性。子囊菌纲的黄枝孢菌效应蛋白可以分泌到胞外被寄主免疫受体所识别(DeWitetal.2009)。然而,锈菌候选的胞外分泌蛋白是否也参与寄主免疫响应有待进一步研究。Petreetal(2016)通过将Mlp候选的效应蛋白注射本氏烟的方法研究其亚细胞定位,结果显示六个效应蛋白定位于细胞核、核仁、叶绿体、线粒体和细胞外。其中一个效应蛋白叶绿体靶蛋白1可以模拟寄主转运肽进入叶绿体和线粒体,表明这些效应蛋白可能操纵线粒体和叶绿体来完成其专性寄生。

5锈菌的基因丢失与生活方式演化

锈菌是活体营养的专性寄生菌,不能人工培养。推测锈菌在进化的过程中可能丢失了部分腐生性营养担子菌类所特有的某些基因。比较分析21种已测序不同营养型真菌基因组中碳水化合物激活酶类基因成分发现,Mlp和Pgt具有相对较少的糖苷水解酶编码基因,数量和担子菌纲的双色蜡蘑较为相似,但是相比半活体营养型、死体营养型和腐生型生物则要少很多。在进化为活体专性营养型的过程中,锈菌类真菌已经失去了一些编码分泌糖苷水解酶和多聚糖裂解酶的基因。但是,编码一些清除植物纤维素和半纤维素的糖苷水解酶的基因家族,例如GH7、GH10、GH12、GH26和GH27均出现了轻微的扩增。这些酶可能在锈菌侵染寄主的初始阶段起主要作用,例如蛋白酶、酯酶和一些碳水化合物激活酶类基因在被侵染的植物体内表达量高度上调,表明这些侵入菌丝可以通过水解酶类穿透进入寄主细胞(ElGueddarietal.2002)。锈菌通过侵入的菌丝在寄主体内形成吸器来获取糖类和氨基酸等养分对于成功建立起活体专性营养型互作具有重要意义。Mlp、Pgt和Mli缺失了一些参与硝酸盐同化吸收的基因,例如硝酸盐和亚硝酸盐转运蛋白以及亚硝酸盐还原酶。Mlp具有基本的硫素同化吸收相关基因,而Pgt、Pst则没有。Pgt缺少了亚硫酸盐还原酶(SiR)的α和β亚基,而Mlp的SiR的β亚基缺失,导致失去转酮醇酶活性,但是在亚麻栅锈菌(Mli)中存在完整的硫素代谢途径。锈菌缺失部分氮素和硫素同化吸收相关途径与他们专性活体寄生方式一致,它们可以通过扩张的转运蛋白家族直接从寄主植物细胞获取氮素(NH4+或氨基酸)和硫素(Spanu,2012)(图4)。锈菌可能通过丢失一些非必需基因来平衡其大进化(macroevolution)压力。

6锈菌基因组变异与毒性演化

在锈菌中,还未发现像水稻大角间座壳那样由于大片段缺失造成分泌蛋白缺失而引起的毒性变异。甚至在比较毒性差异最大的不同生理小种分泌蛋白组时,也没有在任何一个小种中发现超过15个预测的分泌蛋白基因缺失。这表明基因的缺失可能不是造成锈菌毒性改变的主要原因,而不同生理小种的分泌蛋白等位基因的变异可能是造成毒性变异的重要原因。通过重测序4个不同毒性的条形柄锈菌小麦专化型生理小种,生物信息学分析鉴定不同小种候选效应蛋白基因的单核苷酸多态性(SNP)变异,在2999个分泌蛋白中发现5个候选多态性分泌蛋白基因。这些多态性分泌蛋白可能反应不同生理小种条形柄锈菌小麦专化型对特定基因型寄主小麦的快速适应性。Zhengetal(2013)以Pst‐CY32参照基因组,对5个世界范围的重要流行菌系(CY23、PK‐CDRD、Hu09‐2、104E137A‐、Pst‐78)进行重测序分析,检测到超过100000个SNPs。同时还发现不同菌系还存在丰富SV、InDel等遗传变异。其中,分布于编码区的cSNPs占总共SNP数量的35%,这些SNPs可能影响锈菌小种毒性和寄生特性的演化。以此全基因组SNP数据构建的6个菌系的进化关系显示,Pst分离系之间有明显的遗传分化,有性生殖可能在其毒性演化过程中发挥了重要作用。通过对15个落叶松‐杨栅锈菌不同毒性分离系进行了重测序,结果显示与Mlp‐98AG31基因组相比,不同菌系存在大量的单核苷酸变异(SNVs)、多核苷酸变异(MNVs;连续的SNVs)和短序列的插入/缺失变异(InDels)。同时,落叶松‐杨栅锈菌16%的基因上游1000bp区段有超过10个SNPs,表明这些区段可能与基因表达调控有关。

重复序列诱导的点突变是真菌所特有的一种真核生物基因沉默机制,1987年在粗糙脉孢菌Neurosporacrassa中首次发现。Hornseta(l2012)通过对来自担子菌门3个不同亚门(伞菌亚门、黑粉菌亚门、柄锈菌亚门)的8种担子菌转座子的变异分析发现在柄锈菌亚门的落叶松‐杨栅锈菌(Mlp)和禾柄锈菌小麦专化型(Pgt)中存在大量的RIP情况。在Mlp和Pgt中RIP主要发生在Gypsy类转座子的TpCpG三核苷酸区域,使TpCpG转换成为TpTpG,从而形成富含T+A的片段。而在伞菌亚门和黑粉菌亚门中均未发现此类现象。重复序列诱导点突变(RIP)在减数分裂过程中通过突变多拷贝DNA,能最大限度地减少转座子的影响,这一特性被认为是为转座子传播提供的一种防御机制。此外,发生RIP的序列多集中在着丝粒区域,主要是转座子甲基化后的痕迹。

7结语

锈菌类真菌基因组巨大、杂合度高,菌系地理分布广泛、生态位多样,蕴含着众多基因组进化待解之谜。目前,高通量测序的低成本化和第三代测序技术的成熟化为锈菌结构基因组学提供了前所未有的机遇,通过基因组精细测序、群体重测序以及比较基因组学分析可以更深入地揭示锈菌寄生专化性进化和毒性变异的遗传基础。对基因组变异的深入研究将为最终在分子水平揭示其毒性变异机制提供理论依据,为预测新的生理小种的产生及锈病防治提供有力工具。

作者:焦志鑫 申一林 李晶晶 许君 刘娜 康振生 郑文明 单位:河南农业大学生命科学学院  小麦玉米作物学国家重点实验室/河南粮食作物协同创新中心 西北农林科技大学植物保护学院  旱区作物逆境生物学国家重点实验室 

菌物学报责任编辑:杨雪    阅读:人次