电镜超薄切片批量染色探析范文

《电子显微学报》2016年第5期

摘要：

超薄切片染色是透射电镜生物样本制备中的关键环节。本文介绍了一种透射电镜超薄切片染色的新方法，利用简单自制的染色液防污存储与批量染色装置，可对超薄切片载网进行批量化染色，不但极大提高染色效率，而且减少了染色过程中染色液、样品的污染，达到染色液的重复利用，同时减少重金属对操作者的伤害和对环境的污染。

关键词：

超薄切片;批量染色

在生物电镜样品制备中，超薄切片是一种经典方法，电子染色是其中的关键步骤之一。超薄切片电子染色一般采用醋酸铀和柠檬酸铅为染色剂，传统操作方法是:将载有超薄切片的载网的样品面向下悬浮在醋酸铀或柠檬酸铅染液滴上，染色数分钟后用镊子分别夹持载网，将每一片载网依次在双蒸水中上下反复冲洗多次，晾后使用;这种常规染色方法的缺点显而易见:①效率低下，对于大量样品耗时长;②样品染色时间不等，样品染色不均一;③柠檬酸铅极易与空气中的二氧化碳结合产生碳酸铅沉淀污染切片;④染色后需要对每个超薄切片载网分别进行多达几十次的清洗，费时，费力;⑤染液无法重复使用，消耗量大;⑥醋酸铀和柠檬酸铅具有一定的毒性;⑦每次需要清洗染色容器，对环境造成污染。针对常规染色技术容易出现的问题，电镜工作者和专业厂商不断推出各种创新或改良方法与产品［1，2］，但仍存在一些问题，如:①大部分染色装置只能对20个左右的载网进行操作，无法满足日益增长的电镜样品需求;②使用这些染色套装染色完毕，仍要清洗器皿和染色板，操作繁琐，清洗干净与否影响下次染色质量;③染色液无法重复使用，消耗量大;④染色装置价格较高。本文介绍了一种染色液防污存储及批量化染色的新方法［3］，此方法利用电镜实验室常用的实验器材，简单易行，同时可对超薄切片载网进行批量染色，极大提高染色效率，不但减少染色及存储过程中的铅污染，而且将染色操作与染色液存储相结合，染色液重复利用，减少对环境的污染。

1实验材料

带有超薄切片的载网，自制染色胶条(塑料薄片和双面胶，也可购买市售染色胶条)，固体NaOH，10mL离心管，50mL离心管、醋酸双氧铀、柠檬酸铅。

2实验方法

(1)醋酸铀染色液保存于15mL带盖离心管中，避光保存;柠檬酸铅染液保存于10mL带盖离心管中，置于底部有固体NaOH的50mL离心管中(图1)。

(2)自制染色胶条(图2a，也可用市售染色胶条):取具有一定硬度的塑料薄片裁剪成长度小于带盖离心管高度的染色胶条，在胶条中间段一面贴上双面胶，用于粘着载网。将带有超薄切片的载网粘于染色胶条的两侧，确定不会脱落;如果在胶条正反面均贴上双面胶，则可对多达80个载网同时进行染色。

(3)将带有载网的胶条置于装有醋酸铀染色液的离心管中，盖好管盖，染色15～20min(图2b)，然后用双蒸水清洗带有载网的胶条。

(4)将带有载网的胶条置于装有柠檬酸铅染色液的10mL离心管中，敞开离心管的管盖，置入底部有固体NaOH的50mL离心管中，盖紧50mL离心管盖，染色5min(见图2c)。之后取出胶条，以NaOH水溶液、双蒸水依次清洗带有载网的胶条。

(5)待载网干燥后用镊子取下。

(6)醋酸铀及柠檬酸铅染色液无需倒出，可直接置于染色管中保存供下次使用(本实验室可反复染色20次以上):装有醋酸铀染液的15mL离心管直接盖好管盖即可，装有柠檬酸铅染液的10mL的离心管和外部的50mL离心均需盖好管盖。

3实验结果

与常规染色方法比较，新的批量染色法无需清洗染色用具，节省染色时间。而且，染液存储与使用在同一容器中进行，染液可反复使用，节省实验耗材，同时减少对环境污染(表1);电子显微镜观察结果显示，批量染色法所获得电镜图片的对比度适中，结构清晰，无污染。肾小球基底膜电子致密物结构清晰可见(图3a)与传统染色法无明显区别(图3b)。以同一病人肾活检组织块切片，捞片后取载网加到使用不同使用批次的染液中，进行染色，观察和比较第一到第二十批次染色液所染色效果以及其染色污染情况。(100kV透射电子显微镜观察检测两组样品的染色效果，如图4所示，第1(图4a)，第10(图4b)和第20(图4c)次使用的染液所染样品均污染极低。

参考文献:

［1］贺子义，胡冰，史永红．提高电镜超薄切片染色效率的自制装置［J］．电子显微镜学报，2011，30(1):72－74．

［2］李铮，李虹，颜世利，等．新型一次性染色装置改进超薄切片染色技术［C］．电子显微镜学报，2012，增刊:131－132．

［3］王贝贝，王丽，洪健．一种电镜超薄切片批量染色装置:中国，201420368138.2［P］．2014－12－03．

作者:王贝贝 尹伟 刘双双 尚卫娜 谢礼 杨平 郭建胜 王丽 洪健 单位:浙江医学院公共技术平台 浙江生命科学研究院 浙江省农业科学研究院 浙江大学农生环测试中心