风疹病毒多表位诊断抗原的制备范文

《病毒学报》2016年第三期

摘要：

原核表达与层析纯化获取风疹病毒多表位诊断抗原，并初步评价其抗原性。将RV衣壳蛋白Caa3～29、aa96～123以及包膜糖蛋白E1aa208～247三个主要免疫显性表位串联，密码子优化后全基因合成；利用基因重组技术将多表位串联片段插入带有GST标签的表达质粒中，在大肠杆菌中进行表达，并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白；利用WesternBlot（WB）技术对目的蛋白抗原性进行鉴定，并建立RV－IgM抗体检测ELISA技术，初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力。获取高度均质的RV多表位诊断抗原，WB实验表明目的蛋白不但可以被anti－GST单克隆抗体识别，还可以被anti－RV多克隆抗体、RV－IgM阳性血清相应抗体所识别。分别对48份RV急性感染病例的阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测，发现一致性优异。原核表达与层析纯化可以获取抗原性良好的RV多表位诊断抗原，偶联HRP后可以作为检测抗原应用于RV－IgMELISA血清学检测中。

关键词：

多表位抗原；风疹病毒；原核表达；层析纯化；GST标签

风疹病毒（是风疹的病原体，属于披膜病毒科风疹病毒属，为有包膜正义单链RNA病毒，人是唯一宿主。RV只有一个血清型，但有多个基因型，目前共有12个被认可的基因型（1B，1C，1D，1E，1F，1G，1H，1I，1J，2A，2B，2C）和一个临时基因型（1a）正在或曾在世界各地流行［1］。近年来我国RV的流行是由1E和2B基因型共循环引起的多个传播链所致，其中1E基因型为优势型别［2］。RV感染成人一般为自限性疾病，但是孕妇感染，尤其是妊娠前三个月的新发感染将会引发流产、死产或胎儿感染后先天性风疹综合征［3］。鉴于RV的新近感染或急性感染诊断对预防新生儿风疹意义重大，我国已经将RV感染检测作为孕期检测的一项重要内容。临床上通过检测孕妇血清RV－IgM抗体以确定新近感染或急性感染，但目前国内检测人血清RV－IgM抗体诊断试剂盒参次不齐，需要进一步优化。一般来说，新发RV感染的血清学诊断依赖于RV－IgM抗体的检测或者恢复期病人血清IgG抗体水平四倍升高。RV感染的体液免疫应答始于低亲和力IgM抗体的产生，随后抗体类型转换导致亲和力高、免疫效应强的抗体型别产生而消除入侵的病原体。其中补体决定区的体细胞超突变将导致亲和力逐渐增强的抗体产生。抗体亲和力检测也常被用于新发感染与过往感染的区分，但尿素等解离剂打开不同亲和力抗体与抗原的结合程度无法准确把握。因此RV－IgM抗体的检测结果作为临床辅助诊断相对比较客观。RV三个结构蛋白（衣壳蛋白C、两个跨膜糖蛋白E1和E2）均可引发抗体应答，但只有E1蛋白为免疫显性的［4］。免疫沉淀和免疫印迹技术也证实大部分抗RV抗体应答主要由E1蛋白诱发，而且血凝素活性和病毒中和活性都归于E1蛋白的aa208～239，aa213～239，aa214～240［5］。E1aa208～239已被证实是病毒的主要中和表位［6］，并且作为一种多肽诊断抗原构建的ELISA检测方法可以与传统RV检测ELISA、血凝素凝集实验以及病毒中和滴定法相媲美［7］。而且这个表位在不同RV株之间是保守的，已被推荐用来测定保护性免疫ELISA检测指标［7，8］，因此RV诊断抗原中必须包含这个表位。同时E2和衣壳蛋白C也同样能引发机体免疫应答，已经鉴定出E2糖蛋白上一个B细胞表位aa31～105，衣壳蛋白C上两个B细胞表位aa1～30和aa96～123［9］。考虑到衣壳蛋白C在病毒颗粒中的含量以及在病毒生命周期中的重要作用，我们在构建表位依赖性诊断抗原时也同时加入衣壳蛋白C上的两个B细胞表位。谷胱甘肽S－转移酶基因融合表达系统具有蛋白表达、纯化和检测多种用途。氨基端融合日本血吸虫GST的蛋白很早就被证实可以在大肠杆菌（E．coli）中可溶性、高水平的表达［10］。GST自身在E．coli中表达可以自发折叠成具有天然构象的具有酶活性的26kDa蛋白质。拥有GST的全部氨基酸序列的融合蛋白也被证实具有GST酶活性［11］。而且细菌裂解物中的GST融合蛋白利用Glutathione亲和层析介质很容易纯化。本实验中我们将RV多表位抗原插入到GST表达载体中，使其可以表达出GST－RV融合蛋白，一是避免过多的酶偶联到抗原表位上产生空间位阻效应而将抗原位点封闭，二是使融合蛋白可以在E．coli中高效可溶性表达。同时在融合蛋白的羧基端我们添加了His标签，可以利用更加便宜的亲和介质进行目的蛋白的纯化，大大降低了蛋白纯化的成本。本研究利用原核表达系统和层析纯化技术获取的RV串联表位诊断抗原建立RV－IgM抗体捕获法ELISA，来鉴定RV的新近感染或急性感染。

一、材料与方法

1主要材料与试剂E．coliBL21（DE3）和GST载体为科室现存，限制性内切酶NcoI和XhoI以及T4DNA连接酶购自日本TaKaRa公司。

2基因合成根据大肠杆菌密码子偏好表，对多表位串联片段基因序列进行优化（图1），并在其5’端引入NcoI酶切位点，3’端引入XhoI酶切位点，交由大连宝生物公司合成，基因片段大小为314bp，命名为H29F。

3表达质粒的构建基因片段H29F人工合成后存于pMD－19T载体上，用限制性内切酶NcoI和XhoI将目的片段酶切下来，连接到相同酶切处理的GST表达载体（本科室构建，图1）上，转化E．coliBL21（DE3）感受态细胞。次日挑取单克隆菌落进行培养与小量表达，提取阳性克隆质粒进行测序和双酶切鉴定。鉴定正确的质粒命名为H29。4目的蛋白的表达和纯化将新鲜转化H29质粒的E．coliBL21（DE3）接种于含氨苄霉素（50μg／mL）的LB培养基（10g／L蛋白胨，5g／L酵母提取液，10g／LNaCl）中，32℃振荡培养16h后等倍扩菌。37℃继续培养2h后将温度调至35℃，IPTG终浓度1mmol／L诱导4h后离心收菌（3000g，10min，4℃）。用溶液I（10mmol／LTris–HCl，0．5％TritonX－100，pH8．0）重悬菌体沉淀后超声破碎（300w－20s－20s－30次），离心（174000g，10min，4℃）收集上清。上清中加入终浓度为500mmol／L的NaCl后上样于用溶液II（10mmol／LTris–HCl，500mmol／LNaCl，pH8．0）平衡的ChelatingSepharoseFastFlow层析介质中。待上样完毕，用0mmol／L，30mmol／L，60mmol／L，300mmol／L咪唑（溶于溶液II中）进行梯度洗脱，并收集相应洗脱液。分别取样SDS－PAGE电泳观察目的蛋白的含量以及分布情况，将目的蛋白含量最高，纯度最好的洗脱液于基液III（10mmol／LTris–HCl，pH8．0）中进行彻底透析备用。DEAESeph－aroseFastFlow层析介质用基液II平衡后将透析液上样，待上样完毕，用0mmol／L，100mmol／L，200mmol／L，400mmol／LNaCl（溶于基液III中）进行梯度洗脱并收集相应洗脱液。分别取样SDS－PAGE电泳观察目的蛋白的含量以及分布情况。将目的蛋白含量最高，纯度最好的洗脱液于PBS（137mMNaCl，2．7mMKCl，10mM的Na2HPO4，2mMKH2PO4，pH7．4）中彻底透析后，于4℃保存备用。5目的蛋白的鉴定利用WesternBlotting技术对H29抗原性进行鉴定。10μlH29蛋白溶液以及10μlGST标签蛋白溶液（本实验室预制）上样13．5％SDS－PAGE进行电泳（恒流40mA，50min），而后半干转膜至硝酸纤维素膜（NC）（恒压15V，30min）上。转膜完成后，NC膜用封闭液（含5％脱脂奶粉的PBST）于4℃处理过夜。次日分别加入封闭液稀释的Goatanti－Rubellapolyclonalantibody（12000；MerckMillipore）、Mouseanti－GSTmonoclonalantibody（12000；MerckMilli－pore）、RV－IgM阳性血清（120）、RV－IgM阴性血清（120），常温孵育1h后用PBST洗膜5次。检•250•病毒学报32卷测抗体对应为Rabbitanti－GoatIgG－HRPconju－gate（14000；MerckMillipore）、Goatanti－MouseIgG－HRPconjugate（14000；MerckMillipore）和Goatanti－humanIgM－HRPconjugate（14000；MerckMillipore），常温孵育1h后PBST洗膜5次，最后DAB显色，清水终止显色。6H29－HRP偶联反应IgM抗体捕获法ELISA构建中，检测抗原被设计为H29－HRP偶联物。H29－HRP偶联反应按照试剂盒操作步骤操作（KPL，MD，USA）。简言之，纯化的H29去内毒素处理后，在HRPconjugationbuffer中透析，透析完成后将终浓度调整为2．0mg／ml。然后逐滴加入合适体积的SureLINKTMActivatedHRP（HRPH29≈2．51）。缓慢搅拌下，4℃孵育过夜。向溶液中加入10μlReducingAgent（NaCNBH3），室温孵育15min终止反应。最后加等体积2×HRPStorageBuffer，室温孵育15min后，4℃保存备用。利用棋盘法滴定anti－GSTmonoclonalanti－body和H29－HRP评价偶联反应效率。用碳酸盐包被缓冲液二倍系列稀释Mouseanti－GSTmono－clonalantibody（1250～116000），每个微孔板中加入100μl后，37℃孵育2h。用PBS洗涤3次后，每孔加入200μl封闭液封闭包被孔中的非特异蛋白结合位点。37℃孵育1h后，PBS洗涤3次。然后，用PBS二倍系列稀释H29－HRP（1250～116000），每孔加入100μl后，37℃孵育1h。PBS洗涤5次后每孔加入50μlTMB（MP，CA，USA）孵育10min。最后加入50μlH2SO4（1mol／L）终止反应。参考基线波长为620nm，用酶标仪测定450nm波长吸收度值（OD值）。7目的蛋白诊断效能的评价利用H29－HRP建立血清RV－IgM抗体诊断ELISA试剂盒，并对临床和实验室确诊的血清样本进行检测，评价试剂盒对阴阳性血清标本的鉴别能力。简言之，碳酸盐包被缓冲液稀释抗μ－二抗（1500）后包被板条孔，封闭液封闭非特异性位点；加入待测血清（1：10稀释），置37℃孵育1h，然后洗涤；加入H29－HRP偶联物（11000稀释），置37℃孵育1h，然后洗涤；加入TMB显色，参考基线波长为620nm，用酶标仪测定波长为450nm吸收度值（OD值）。

二、结果

1目的蛋白的构建与表达纯化H29的构建如图1，融合蛋白的氨基端为GST标签，紧跟着衣壳蛋白两个抗原表位（aa3～29和aa96～123），然后是E1aa208～247抗原表位，羧基端为His标签，间隔中添加了必要的连接臂（如GGGS等）以及合适的酶切位点（如NdeI、NcoI和XhoI）。双酶切处理（NcoI和XhoI）GST表达载体和H29F－pMD－19T获取带有相同粘性末端的载体（大约6170bp；图2A）和H29片段（约314bp；图2B），经过连接酶连接转化入E．coliBL21（DE3）感受态细胞后进行培养，测序、小量表达（图3A）和双酶切鉴定结果（图2C）证实目的片段已经成功插入表达质粒中，并将正确质粒命名为H29质粒。挑取6个新鲜转化H29质粒的E．coliBL21（DE3）单克隆菌落培养适当时间后进行诱导表达，SDS－PAGE电泳结构发现，与对照组相比，在约37kDa处有明显表达条带（图3A），表明H29蛋白可以在大肠杆菌中有效表达。大量表达后发现目的蛋白主要存在于超声菌体沉淀重悬液的上清中（图3B），目的蛋白含量达到34．17％。将上清液进行处理后利用His亲和层析进行纯化，电泳结果发现，目的蛋白主要存在于300mmol／L咪唑洗脱液中（图3B），并且目的蛋白含量达到了92．21％，浓度为2．2mg／mL。300mmol／L咪唑洗脱液经过完全透析后，上DEAE阴离子交换层析柱，电泳结果发现目的蛋白主要分布于200mmol／LNaCl洗脱液中，并且目的蛋白的含量达到了94．86％，浓度为2．1mg／mL（图3B）。最后将200mmol／LNaCl洗脱液在PBS中进行透析，4℃保存备用。2目的蛋白的鉴定根据目的蛋白中包含GST、RV表位等特征，对H29蛋白的抗原性进行初步鉴定。WesternBlot结果显示，利用羊抗RV多克隆抗体、鼠抗GST标签抗体以及RV－IgM阳性血清作为捕获抗体，其相应二抗作为检测抗体，在NC膜上相应位置都出现了明显条带（图4）；并且RV－IgM阴性血清作为捕获抗体，在NC膜上相应位置没有出现对应条带。表明了H29蛋白包含了RV抗原表位和GST标签。3目的蛋白诊断效能的评价通过棋盘滴定法确定H29－HRP最适工作浓度为11000，并且表明H29和HRP已经成功偶联，可以应用于RV－IGM抗体检测ELISA试剂盒的建立。利用H29－HRP偶联蛋白作为诊断抗原建立RV－IgM抗体检测ELISA试剂盒，分别对48份阳性血清、阴性血清和健康人群血清样本进行检测（表1）。从图5可得出，阳性血清样本、阴性血清样本以及健康人群血清样本A值分布范围分别为1．60（1．21～1．76，95％置信区间）、0．34（0．25～0．49）和0．23（0．17～0．37）。以阴性结果平均数的2．1倍粗略估算ELISA试剂盒的cutoff值为0．5985，得出其灵敏度为95．84％，特异性为91．67％。并且阳性血清样本与阴性血清样本和健康人群血清样本A值分布明显不同（P＜0．05），而阴性血清样本与健康人群血清样本A值分布无明显区别（P＞0．05）。对表1数据进行卡方检验，我们发现，其χ2＝2．5，P＝0．1138＞0．05，说明ELISA诊断结果与临床和实验室确诊结果之间无统计学意义。而且kappa值为0．8485，表明一致性优越。因此，新型RV－IgM抗体诊断试剂盒可以很好地鉴别阴阳性血清样本。

三、讨论

本研究中，我们选择了RVE1蛋白上已经被用图5H29抗原诊断效果评价Figure5EvaluationofthediagnosticeffectofH29protein于ELISA检测的一个重要显性表位aa208～247，而且添加了衣壳蛋白C的两个表位aa3～29和aa96～123作为诊断抗原，其目的是提高诊断试剂的灵敏度。虽然与包膜蛋白E相比，在诱发免疫应答产生中和活性方面C蛋白抗原表位处于次要地位，但对于诊断而言C抗原意义也很重要［8，12］。在PeleD等研究中［8］，衣壳蛋白C多肽抗原与RV阳性血清反应的滴度都在11600以上，表明RV阳性血清中存在大量与C蛋白上抗原决定簇可以发生反应的抗体（已排除非特异结合反应的存在），并且通过动物实验证实C抗原也具有较高的免疫原性，可以诱发强烈的抗体应答。针对目前市场上主要以E蛋白作为诊断抗原的试剂盒出现不同程度漏检的现象，本研究添加C蛋白上的特异表位，旨在初步探索提高诊断试剂灵敏度的方案。GST作为融合蛋白前缀有效提高H29蛋白在原核表达系统中表达量的同时，也在一定程度上增强了其可溶性表达（图3B）。WesternBlotting实验证实了H29携带RV病毒的主要免疫显性表位，并且可以与RV－IgM阳性血清中的相应抗体发生反应，初步证实了其抗原性可以应用于新近感染或急性感染的诊断。另外我们将H29与HRP进行了偶联，并通过棋盘滴定法评价了偶联效果以及确定了H29－HRP的最适工作滴度，为成品试剂盒的研发鉴定了基础。此方法不但通过添加GST前缀有效避免了HRP偶联带来的抗原效价降低或失活，还将衣壳蛋白C的两个B细胞表位纳入诊断抗原分子中，同时提高了检测方法的灵敏度和特异性。虽然H29与HRP偶联实验的重复性优异，但是是过GST吸引HRP偶联还是其他原因避免或者减少诊断抗原表位发生偶联还待进一步研究。另外，本研究中诊断抗原中保留GST和His标签，一是为了偶联反应中减少对RV表位的偶联反应，二是为了稳定串联表位在GST表面的有效展示，至于两个标签对诊断抗原特异性的影响还需要进一步的研究，据目前许多诊断抗原的研究中大多也携带着标签。并且新建立的IgM诊断试剂是以捕获法ELISA作为基础研制，已经将标签的影响降低到了最低。我们利用本实验室保存的临床和实验室诊断确定的阴阳性血清作为血清盘进行抗原诊断能力的评价，尚未按照商品化血清学诊断试剂研发的要求，采用检定所或其他权威机构建立并提供的系列血清，并就检测特异性及敏感度与国际上的商品试剂作比较。本研究旨在新型诊断抗原的构建制备、抗原性研究以及其诊断能力的初步探索，实验将进一步拓展。总之，我们筛选出RV结构蛋白上的抗原表位，并将其串联在GST标签的羧基端，让其在原核表达细胞中进行表达，利用亲和层析和离子交换层析成功获取了带有GST前缀蛋白和His后缀标签的诊断抗原，并将其应用于风疹病毒新近感染和急性感染的诊断，证实了H29诊断抗原在ELISA检测技术中的实用性，很好地解决了RV抗原在偶联HRP过程中造成的抗原失活或抗原效价降低，有效提高了检测试剂盒的灵敏度和特异性。

作者：苏秋东 郭敏卓 邱丰 贾志远 卢学新 孟庆玲 田瑞光 毕胜利 伊瑶 单位：中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 北京出入境检验检疫技术中心