石榴叶多酚的抗氧化活性研究范文

《南京师大学报》2015年第五期

石榴（PunicagranatumL.）别名安石榴、海榴、单若、金罂、天浆等，是石榴科石榴属植物，为落叶灌木，在我国分布广泛，目前全国石榴栽植面积达64668hm2，居世界第一位［1］.石榴的叶子具有收敛止泻、杀虫、治疗痘风疮、癞疮、跌打损伤等一系列功效.虽然石榴叶具有多种生理功能，但其利用率不高，大多数的石榴叶都作为农业垃圾处理，造成资源的浪费［2-4］.据报道石榴中含有丰富的安石榴苷、没食子酸、鞣花酸、短叶苏木酚等多酚类化合物［5-8］.该多酚类化合物在抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、调节血脂等方面都显示了巨大的药用价值和潜力［9-12］.但是目前对石榴叶粗多酚（crudepolyphenolsfromPunicagranatumL.leaves，CPPL）的纯化研究较少.本研究通过吸附、解吸实验考察了大孔树脂对CPPL的纯化效果，并对其分离纯化工艺进行优化，进一步比较了CPPL、石榴叶多酚1（purifiedpolyphenolsfromPunicagranatumL.leaves1，PPPL1）与石榴叶多酚2（purifiedpolyphenolsofcrudepolyphenolsfromPunicagranatumL.leaves2，PPPL2）的抗氧化性.以期为提高石榴叶的经济利用价值提供一定的实验依据.

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.1.1材料石榴（PunicagranatumL.）叶采于江苏省南京市鼓楼区，洗净烘干，经粉碎机粉碎后，过60目筛，避光保存备用.大孔树脂AB-8、聚酰胺购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司.

1.1.2试剂乙醇、盐酸、无水碳酸钠购自南京创化化玻仪器有限公司；没食子酸标准品购自美国Sigma公司；Folin-酚试剂购自南京荣世德贸易有限公司；芦丁（Rutin）标准品由中国药品生物制品检定所提供.

1.1.3仪器高速万能粉碎机购自天津市泰斯特仪器有限公司；旋转蒸发器购自上海亚荣生化仪器厂；循环水真空泵购自南京科尔仪器设备有限公司；JY92-II超声波细胞破碎器购自宁波新芝生物科技股份有限公司；GL-22M高速冷冻离心机购自湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；722可见分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司；恒温水浴锅购自金坛市杰瑞尔电器有限公司.

1.2石榴叶多酚制备的方法

1.2.1石榴叶多酚的制备CPPL：准确称取2g粉末样品，以20∶1液料比加入50%的乙醇水溶液，超声破碎后，调节pH为2，置水浴锅水浴1.5h，5000r/min离心10min后过滤，取一定量的滤液用Folin-Ciocalteu法测定吸光度，计算多酚浓度［13］.PPPL1：将上述CPPL旋转蒸发后冷冻干燥，过AB-8得到PPPL1.PPPL2：按文献［14］的方法将上述PPPL1过聚酰胺得到PPPL2.

1.2.2石榴叶总酚含量的测定没食子酸标准曲线的绘制：分别吸取100mg/L没食子酸备用液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL于试管中，依次加入80%乙醇溶液补充至1mL，得到0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的没食子酸标准系列.取0.2mL标准液于试管中，分别加入2mL0.5mol/LFolin-酚试剂，混匀后在室温下静置4min，然后用2mL饱和碳酸钠中和，室温条件下在暗处放置2h后用分光光度计在760nm波长下测定吸光度.以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为：y=0.0068x+0.0194，R2=0.9954.石榴叶总酚含量的测定：取一定浓度的样品溶液0.2mL，后续步骤同标准溶液测定方法，根据标准曲线求得其浓度，并计算出总酚含量.

1.3石榴叶多酚纯化的工艺条件

1.3.1大孔树脂的预处理将树脂用无水乙醇室温下密封浸泡8h，水洗至无醇味，用5%盐酸溶液浸泡8h，水洗至中性，再用5%NaOH液浸泡8h，水洗至中性，加水备用.

1.3.2大孔树脂静态吸附及解吸附动力学曲线的绘制称取抽干大孔吸附树脂2g，分别装入具塞磨口三角瓶中，加入一定浓度的提取溶液50mL，置于振荡器中（25℃，180r/min）静态吸附12h.期间每隔一定时间用注射器吸取少量溶液，测定其多酚浓度，绘制静态吸附动力学曲线.将充分吸附后的树脂2g用蒸馏水清洗至树脂表面无提取溶液残留，滤纸吸干树脂表面残留的溶液，然后置于具塞三角瓶中，加入50mL95%乙醇，于相同条件下解吸6h，期间每隔一定时间用注射器吸取少量溶液，充分解吸后取上清测定总多酚的浓度，再按如下的公式计算吸附量、吸附率和解吸量，绘制静态解吸附动力学曲线。

1.3.3静态吸附与解吸条件的优化分别考察提取液多酚质量浓度、提取液pH值、上样流速对树脂吸附的影响，考察乙醇体积分数及洗脱剂用量对树脂解吸的影响.

1.4石榴叶多酚的抗氧化活性

1.4.1亚硝酸盐的清除参照王树庆等的方法并有所改动.分别在试管中加入1mL一定梯度的样品溶液，再分别加入5mL一定浓度的NaNO2溶液，37℃恒温水浴30min，随后加入1mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置15min后加入0.5mL盐酸萘乙二胺溶液，加蒸馏水3.5mL，混匀，静置15min，最后于538nm波长处测定吸光值，亚硝酸盐清除率计算如下。

1.4.2还原力的测定参照Seordino等的方法并有所改动.在2.5mLpH=6.6的磷酸盐缓冲液中加入不同浓度的样品溶液1mL，并加入1%的铁氰化钾溶液2.5mL，混合，50℃恒温水浴20min，再加入10%的三氯乙酸溶液2.5mL，5000rpm离心10min，取上清液2.5mL，加蒸馏水2.5mL和0.1%FeCl3溶液0.5mL，混匀后静置10min，在700nm处测定吸光值，以50%的乙醇溶液为空白对照.

1.4.3超氧阴离子自由基的清除采用邻苯三酚法，取pH8.2的磷酸缓冲液3mL，分别加入一定体积的样品溶液，并使用去离子水使反应体系补至9mL，混匀，25℃水浴平衡20min.然后加0.6mL7mmol/L的邻苯三酚，混匀，立即放入分光光度计中，测定325nm处的吸光值，记录反应5min后的结果（测各样品时，以去离子水代替邻苯三酚作为空白管）.超氧阴离子自由基的清除计算公式如下。

1.4.4羟自由基的清除采用改良的水杨酸法［29］，分别取1mL不同浓度的多酚或者芦丁溶液，加入1mL9mmol/LFeSO4，1mL9mmol/L水杨酸-乙酸溶液，最后加入1mL8.8mmol/LH2O2启动反应，37℃反应0.5h，以蒸馏水为空白对照，考虑到多酚本身的吸光度值，以加入1mL蒸馏水代替H2O2的反应液作为多酚的本底吸收值，在510nm处测量各浓度的吸光度.

2结果与分析

2.1石榴叶多酚纯化工艺2.1.1AB-8树脂吸附及解吸附石榴叶多酚的动力学特性曲线由图1AB-8吸附动力学可知，0min~200min内，随着吸附时间的增加，AB-8树脂吸附多酚量增加，200min后已经基本达到吸附饱和，说明AB-8树脂属于快速平衡型树脂.由图2解吸动力学曲线可知，在80min左右时，已经达到了最大解吸量.以上实验结果表明，AB-8树脂能快速地达到吸附平衡和解吸平衡，是富集和洗脱CPPL的理想树脂.

2.1.2多酚浓度对吸附量的影响由图3可知，CPPL浓度在0.2mg/mL~2.0mg/mL之间，树脂的多酚吸附量随着浓度的增加而迅速增加，浓度为2.0mg/mL~3.5mg/mL时，吸附量随浓度增加变化缓慢.由此可得出，提高上样浓度虽然有利于提高树脂的使用效率，但是上样浓度过高时，上样液易出现絮凝现象，造成树脂堵塞，反而降低其吸附能力，因此选定上样液粗提物浓度为2.5mg/mL较为合适.

2.1.3pH对吸附量的影响由图4可知，AB-8对CPPL的吸附量先升高后下降，在pH=4时吸附率达到最大，pH=7时吸附率最低，其原因可能是上样液pH的变化可以改变目标成分在溶液中存在的形式，影响其溶度，从而影响目标成分与大孔吸附树脂的分子间作用力.多酚类化合物呈酸性，在微酸性条件下吸附效果较好，因此选pH=4为宜.

2.1.4上样流速对吸附效果的影响以流出液累积体积为横坐标，流出液浓度为纵坐标作图，由图5可知，上样流速分别为1mL/min、2mL/min、3mL/min、4mL/min时，泄漏点分别出现在160mL、130mL、100mL、90mL附近，流速为1mL/min时，虽然泄漏点出现的最迟，但因为流速慢，导致生产周期过长、多酚被氧化.综合考虑后，选择上样流速为2mL/min.

2.1.5乙醇浓度对树脂解吸的影响由图6可以看出，随着乙醇体积分数的升高，解吸率先上升后有下降趋势，在40%~60%之间时，解吸率上升幅度较快，当乙醇体积分数为60%时开始下降.因此，从节约资源的角度考虑选用60%乙醇溶液对CPPL进行洗脱.2.1.6洗脱剂用量的确定由图7可知洗脱曲线呈高斯分布，表明AB-8树脂对CPPL有很好的洗脱能力.树脂上吸附的多酚类物质易洗脱，洗脱峰比较集中，当洗脱体积为40mL~60mL时，洗脱液中的多酚含量最高.洗脱剂用量为80mL即1.7BV，CPPL基本被完全洗脱，在此基础上，再增加洗脱剂用量，解吸量虽有所增加，但增幅很小.因此，从节约成本出发，宜以1.7BV~2.0BV左右的洗脱剂用量进行洗脱.

2.2石榴叶多酚的抗氧化活性

2.2.1对亚硝酸盐的清除作用由图8可知，CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin均对亚硝酸盐有较好的清除效果，且随浓度的增大清除率也随之增大.CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin的IC50分别为：307.42mg/L、133.95mg/L、102.94mg/L及227.00mg/L.结果表明：PPPL1和PPPL2对亚硝酸盐的清除作用明显好于Rutin及CPPL，且在相同浓度下PPPL2的清除效果也明显好于PPPL1.提示随着石榴叶多酚纯度的提高其清除亚硝酸盐的能力也会增强.

2.2.2还原力的测定由图9可知，在试验浓度范围内，石榴叶多酚的还原能力与浓度呈一定的量效关系，还原能力随多酚的质量浓度增加而增强.相同浓度下，4种样品的还原力为：PPPL2>PPPL1>Rutin>CPPL.CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin的IC50分别为：94.78mg/L、56.93mg/L、30.77mg/L、77.32mg/L.说明纯化有利于提高石榴叶多酚的还原能力，通过纯化后的石榴叶多酚的还原力强于Rutin.

2.2.3对超氧阴离子自由基的清除作用由图10可知，CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin均对超氧阴离子有较好的清除效果，且随浓度增大清除率也增大，4种样品对超氧阴离子的清除能力顺序为：Rutin>PPL2>PPL1>CPPL，CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin的IC50分别为：441.27mg/L、369.70mg/L、255.15mg/L、59.78mg/L.表明石榴叶多酚对超氧阴离子有一定的清除作用，且经分离纯化后对超氧自由基的清除作用得到增强.

2.2.4对羟自由基的清除作用由图11可知，在0mg/L~25mg/L范围内石榴叶多酚及Rutin对羟自由基的清除率呈现一定的量效关系.PPPL2在0mg/L~5mg/L时就显示出较强的清除效果，而CPPL在此浓度范围内则几乎没有对羟自由基起到清除的效果；当浓度达到25mg/L时，PPPL2、PPPL1及Rutin对羟自由基的清除率并没有明显的差异.CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin的IC50分别为：22.25mg/L、14.89mg/L、13.07mg/L、9.15mg/L.表明随着纯度的提高，清除羟自由基的效果越好，说明石榴叶多酚经纯化后其生物活性能更好地发挥出来.

3讨论

自由基是人体内普遍存在的一类物质，主要包括超氧阴离子（O2-•）、羟自由基（•OH）等氧自由基和氮自由基.正常情况下，体内存在的防御系统能够有效清除多余的自由基.但是生活中大气污染、辐射、吸烟和营养过剩等问题极易使人体内自由基增多，从而导致氧化损伤，这将直接或间接地引起蛋白质变性、生物膜结构损伤等一系列病变，严重的可造成死亡［30］.另外当人体摄入硝酸盐和可亚硝基化的胺类后会在体内形成N-亚硝胺，只有在体内阻断亚硝胺的前体，才能有效防治癌症.天然抗氧化剂如多酚类、多糖类、维生素等被广泛运用到食品和化妆品中帮助清除自由基，起到抗氧化作用，并阻断亚酸胺合成的作用，保障人体健康.因此研究天然高效低毒的抗氧化剂已成为当今研究的热点，近些年人们已由原来研究人工合成抗氧化剂转移到研究从天然植物中筛选抗氧化成分上.本实验得出石榴叶多酚纯化的最佳工艺条件为：AB-8的最佳饱和吸附及解吸时间为200min和80min，上柱质量浓度2.5mg/mL，pH为4，上柱速率2mL/min.由动态解吸附试验又得到最适AB-8的解吸条件为：乙醇体积分数60%，洗脱量1.7BV~2.0BV.在此条件下，CPPL的纯度由39.67%提高到62.44%，并采用聚酰胺树脂对PPPL1进行分离，得到了纯度为92.83%的PPPL2.研究石榴叶多酚的抗氧化作用，得出其对超氧自由基、羟自由基、亚硝酸盐的清除率以及还原能力随着样品浓度的增加和纯度的提高不断上升.其中PPPL1、PPPL2及Rutin对亚硝酸盐的半抑制率分别为：133.95mg/L、102.94mg/L、227.00mg/L，还原力的IC50值分别为56.93mg/L、30.77mg/L、77.32mg/L.由此可以看出PPPL1和PPPL2在还原力及清除亚硝酸盐能力上比Rutin具有更强的抗氧化效果.因此进一步探究提高石榴叶多酚纯度的方法和石榴叶多酚抗氧化活性方面的研究将对石榴叶作为天然抗氧化剂的开发具有重要意义.

作者：邢佳 陆文娟 赵云霞 陶明煊 单位：南京师范大学金陵女子学院