病原菌变化的污水处理论文范文

1材料与方法（MaterialsandMethods）

1.1样品采集

污水样品分别采集于北京市GBD污水处理厂（Anaerobic/Aerobic(A/O）工艺，简称G-AO）、QH污水处理厂（Anoxic-Anaerobic-Aerobic（A2/O）工艺，简称Q-A2O）、JXQ污水处理厂（OxidationDitch工艺，简称J-OD）和WJC污水处理厂（SequencingBatchReactor（SBR）工艺，简称W-SBR）。以上四个污水处理厂工艺概况如表1。采样时间自2010年7月至2011年5月，考虑到夏末秋初是流行病的高发季节，故在2010年7、8、9月各采样一次，而在秋（2010.11）、冬（2011.2）、春季（2011.5）各采样一次。每次所取水样充分混合后保存于样品冷藏箱，并在两小时内带回实验室。

1.2试验方法

1.2.1样品预处理及细菌DNA提取：进水样品和初沉池出水样各100mL，各工艺中段样品10mL，剩余污泥样品5mL，二沉池出水500mL，且各采样点进行等体积平行取样。水样处理采取抽滤的方式，将样品通过0.22μm的滤膜，微生物被截留在滤膜上，将滤膜剪碎，放入DNA提取试剂盒配套的管子中。按照FASTprep系列试剂盒(MP，美国)的说明书进行逐步提取(Nazarianetal.,2008)。且每个平行样品提取时均做一重复，提取后将每个平行样品的两份DNA溶液进行混合，以减少单一水样采集和DNA提取时造成的误差。最后采用Nanodrop微量分光光度计(Thermo，美国)进行DNA的含量测定，并对所提取基因组DNA分装备份保存于-20℃，以用作后续PCR及定量PCR分子生物学分析中的DNA样品。

1.2.2PCR引物特异性及反应体系：所用引物如表2所示，其中对于大肠杆菌检测引物的选用主要参照Bej,Tsai等人(Tsaietal.,1993；Bejetal.,1991)和Maheuxa等人(Maheuxetal.,2009)，研究证实uidA基因具有更好的特异性和灵敏性；沙门氏菌检测引物的选用主要参照Andreas等人(Hadjinicolaouetal.,2009)和Rahn等人(Rahnetal.,1992)基于invA基因设计引物；而军团菌特异性引物的选用，则主要依据Miyamoto(Miyamotoetal.,1997)和Sheehan等人(Sheehanetal.,2005；WullingsandvanderKooij,2006；Carvalhoetal.,2007)的研究应用。PCR反应体系（50μL）为：5μLPCR缓冲液；4μL0.25mmol/LdNTPs；1μL10μmol/L正向引物；1μL10μmol/L反向引物；0.25μL20mg/LBSA；0.25μL1.25UTaqDNA聚合酶；2μL水样DNA（约10ng）；灭菌去离子水36.5μL。反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性1min，退火温度（参见表2）下退火1min，72℃延伸1.5min，整个过程进行35个循环，最后72℃下延伸10min。通过1%（w/v）的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。标准样品的建立：利用FermentasDNA纯化试剂盒（MBIFermentas,加拿大）对上述PCR产物进行纯化。连接到pGEM-TEasy载体上（Promega,荷兰），利用化学方法转化到DH5-α感受态细胞中（Takara,日本），在37℃，170rpm条件下培养1h。接着将转化混合液涂布于含有氨卡青霉素（50μg/ml）、X-Gal和IPTG的培养皿中，在37℃下培养15h。通过蓝白斑筛选阳性克隆体，采用M13F（5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’）和M13R（5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’）对阳性克隆体中的目标基因片段进行特异性扩增。通过琼脂糖凝胶电泳检测M13PCR产物，采用ABI3730基因测序仪进行测序分析(Attardetal.,2010)。将测序结果提交到NCBI，进行BLAST比对。将插入正确的菌液，利用TIANGEN质粒提取试剂盒（TIANGEN，中国），取3ml菌液进行质粒提取,由nano-drop仪器测定该质粒浓度，其质量浓度为ng/μl，即质粒DNA在单位微升溶液中的质量，并可由公式（1）换算成单位（copies/μl），从而以该质粒作为定量PCR的标准品。定量PCR反应：以上述已知质粒浓度的标准品为标准模板，进行10倍梯度稀释，。以水样中各细菌DNA为待测模板，采用与普通PCR相同的引物（表2）。采用实时荧光定量PCR，药品采用TaqSYBRGREEN1(Takara，日本)，其反应总体系为25μl：12.5μl的SYBRGreen1染料（2X）；0.5μl100umol/L正向引物；0.5μl100umol/L反向引物；0.5μl的ROX染料（50X）；0.5μl的BSA；2μl水样DNA（约10ng）；灭菌去离子水8.5μl。将定量PCR混合液放入8连管(ABI美国)中，用超净管盖封闭，将反应管放入定量PCR仪(ABI7300，美国)中进行分析。其中标准样品和待测样品均为同一批次内进行平行测定3次，并计算3次CT值间的变异系数，以验证结果的精确度。最终结合SDSsystemsoftware软件分析，得到动力学曲线及标准曲线，进而计算出单位毫升待测水样溶液中相应细菌基因的拷贝数，为绝对定量。单位为copies/(ml水样)，记作copies/ml。对三种菌的标准曲线进行线性回归分析得到标准曲线方程分别为：（1）大肠杆菌标准曲线方程：CT=-3.3511X0+40.073，R²=0.9958；（2）沙门氏菌标准曲线方程：CT=-3.1902X0+35.142，R²=0.9902；（2）军团菌标准曲线方程：CT=-3.1674X0+38.22，R²=0.9958。其中，X0为标准模板浓度的对数。三种菌的标准曲线相关系数R²均大于0.990，且对同批次3个平行样品间Ct值的变异系数分析发现，大肠杆菌、沙门氏菌和军团菌的变异系数均较小，分别小于等于1.541%、2.326%和2.115%。说明所建立的标准曲线具有较高的精确度和可信度。

2结果与分析（ResultsandAnalysis）

2.1不同污水处理厂及四季中大肠杆菌调查分析利用定量PCR技术，连续对Q-A2/O、J-OD、W-SBR和G-A/O四个污水处理厂中大肠杆菌浓度变化进行为期一年的调查，结果如图1所示。整体而言，四个季节中大肠杆菌在四个污水处理厂各水处理阶段都可检出。从大肠杆菌进水浓度的季节性分布来看，其中以夏季进水中大肠杆菌浓度为最高，在107-108copies/ml，明显高于其他三个季节一个数量级左右，这也与Molleda(Molledaetal.,2008)和Thurston(Thurstonetal.,2001)等人针对大肠杆菌的季节变化研究结果基本一致；大肠杆菌在冬季进水中的浓度普遍偏低，在106copies/ml左右。从四个污水处理厂大肠杆菌出水浓度来看，也表现出明显的季节性差异，尤以夏季出水浓度最高，为105copies/ml左右，春秋次之，而基本以冬季为最低，主要在103-104copies/ml之间。尽管各污水处理厂中大肠杆菌出水浓度依旧较高，但相比于进水浓度107-108copies/ml，已大致减少了三个数量级以上，可见四个污水处理厂对大肠杆菌的去除均表现出了良好的效果，其中以G-A/O去除效果最好，四季平均去除效率达99.88%；其次为W-SBR和J-OD，二者四季平均去除效率分别为99.73%和98.45%，尽管Q-A2/O相较于其他三者，其处理效果有一定波动，四季中去除效率最低也可达90%，而四季平均去除率为96.45%，可见其去除效果已属良好。但从各厂污泥样品中浓度来看，主要集中在105copies/ml左右，最高甚至达106copies/ml以上，相较于其它污水处理工艺段程度均有所回升，且高于出水浓度近一个数量级。此外，大肠杆菌在Q-A2/O的沉砂池、J-OD的沉砂池以及G-A/O的初沉池中的分布浓度相较于以上三个工艺进水中大肠杆菌的浓度而言，并未表现出显著性的降低。

2.2不同污水处理厂及四季中军团菌调查分析军团菌在Q-A2/O、J-OD、G-A/O和W-SBR四个污水处理厂及四季中的含量变化如图2所示。军团菌在四个污水处理厂中的含量变化相较于大肠杆菌的分布变化来说，二者差异显著。尽管军团菌在各污水处理阶段均可检出，但就进水季节性变化来说，四个污水处理厂的四季进水浓度基本接近，在104-105copies/ml，并未显示出明显的季节性变化。从各污水处理厂对军团菌处理效果来看，军团菌数量减少并不明显，出水浓度仍基本维持在104copies/ml左右，与进水几乎持平，甚至部分水厂出现二沉池出水浓度反而升高的现象。此外，从军团菌在各污水处理厂工艺段中的分布情况来看，也有差异。其中，在污水进入Q-A2/O、W-SBR与G-A/O的曝气阶段及回流污泥和剩余污泥阶段后，军团菌浓度出现了不同程度的升高，其中以W-SBR升高幅度最为明显，其曝气后污泥中军团菌浓度相比于进水浓度升高约2个数量级，在106copies/ml以上；出水中浓度下降亦不明显；而军团菌在J-OD中的浓度变化表现出了与前三者明显的差异，其氧化沟及回流污泥中军团菌数量相比于进水，锐减数量超2个数量级，浓度不到102copies/ml的一半，而军团菌在出水中却表现出了激增，排放浓度超过103甚至达到104copies/ml。就工艺类型对军团菌去除效果来看，以G-A/O去除效果最好，四季平均去除效率达93.48%；其次为J-OD，可达90%，而Q-A2/O只表现出了一定的去除效果，四季平均去除率为41.63%，且主要在秋冬两季有去除效果，而W-SBR工艺出水中浓度反而高于进水浓度。

2.3不同污水处理厂及四季中沙门氏菌调查分析如图3所示，为沙门氏菌在四个污水处理厂及四季的分布变化调查结果。沙门氏菌在四个污水处理厂中四季的分布变化与大肠杆菌、军团菌也大不相同，其进水浓度较低，基本在102-103copies/ml，而在J-OD和G-A/O的春季进水中均未检出，除了在冬季进、出水中保持了相对较高含量外，并未表现出明显的季节性变化规律；就去除效果来看，经各污水处理厂处理后，出水中沙门氏菌浓度有一定的削减，但并不明显，其中以G-A2/O和Q-A/O去除效果相对较好，J-OD、W-SBR较弱；相对其它季节而言，冬季进水中沙门氏菌的浓度相对较高，四个污水处理系统对其去除效果并不理想，出水中浓度降低并不显著，可见冬季较低的温度对沙门氏菌影响不大。另一方面，从沙门氏菌在各处理工艺沿程分布情况来看，除其在Q-A2/O、J-OD的沉砂池及G-A/O的初沉池中均可检出外，在此四个工艺处理的其他阶段均未检出，尤其在剩余污泥样品中也未有沙门氏菌检出，这与魏梦楠(魏梦楠,2010)针对污水再生水检测研究结果基本一致。

3讨论（Discussion）

我国最新颁布的城镇污水处理厂污染物排放标准（GBl8918-2002）中仅对粪大肠杆菌（其中大肠杆菌属于粪大肠菌群中的一种）数量做出明确规定，但未涉及其它高致病菌的限定。因此，对于污水处理系统中其它高致病菌的分布开展调查研究显得十分必要。从本研究针对北京市Q-A2/O、J-OD、G-A/O和W-SBR四个污水处理厂为期一年的调查结果来看，大肠杆菌在四种系统中的浓度变化表现出明显的季节性规律，其在夏季的进水和出水中浓度为最高；沙门氏菌仅在冬季进、出水中保持了相对较高含量；而军团菌并未表现出明显的季节性规律。就大肠杆菌、军团菌和沙门氏菌在污水处理系统中含量差异而言，军团菌在四种系统进水中浓度在104-105copies/ml之间，较大肠杆菌进水浓度低约2个数量级，而其在出水中的浓度却与大肠杆菌出水中浓度较为相近，主要集中在104copies/ml左右；沙门氏菌在四种系统进水中浓度低于103copies/ml，不及进水中大肠杆菌浓度的1/1000，且沙门氏菌主要在冬季进、出水中有所检出，而在水处理的主要工艺段并未被检出。可见，所调查的北京市四个污水处理厂污水中的病原菌主要还是以大肠杆菌为主，军团菌次之，沙门氏菌为最少。此外，研究结果也从侧面反映出大肠杆菌、军团菌和沙门氏菌在四种系统中的分布并未表现出直接的相关性，这与早期Rahman(Rahmanetal.,1996)在有关大肠杆菌、沙门氏菌及其他病原菌的水域传染病相关性研究的结果一致。从季节变化对病原菌去除效果的影响来看，四种系统在冬季对三种病原菌的去除率均较低；而在夏季，除军团菌外，四种系统对于大肠杆菌和沙门氏菌的去除率最好，可见季节性变化对于病原菌的去除效果具有一定的影响，这一结果与印度污染控制委员会07年所的水质报道(Bhawan,2008)结果基本一致。然而，在夏季，虽然去除率高，但排放的病原菌浓度依然保持较高水平，尤其军团菌在夏季的排放浓度较其他季节高出很多，这也进一步印证了为什么往往在夏季水媒型传染病暴发风险较高。在冬季，沙门氏菌在四种系统中含量相对较高，这与Stampi等(Stampietal.,2000)研究发现沙门氏菌在温度较低和湿度较高的10月—3月期间含量更高的结果基本一致，其原因是沙门氏菌在温度较低和湿度较高的冬季表现出更强的活性，从而更容易在与其他菌群竞争中获优势；在夏季，温度较高，有利于其它细菌繁殖生长，含量较低的沙门氏菌在与其它菌群竞争中处于劣势，较难存活。此外，PlachaI(Plachaetal.,2001)也研究发现相比于温度较高的夏季，沙门氏菌在温度更低的冬季活性更高，而且发现在夏季和冬季相同pH变化幅度下，夏季pH的波动更容易导致沙门氏菌的死亡。本研究发现大肠杆菌和军团菌在剩余污泥样品中的分布较出水中更高，这与Gaspard等(GaspardPetal.,1997)对法国89个污水处理厂污泥中病原物分布调查发现的结果一致。以上结果也与多数研究(Deportesetal.,1995;Sahlströmetal.,2003;Lewisetal.,2002)一致，证实了微生物易于被活性污泥絮体吸附而沉积，因此更多研究者更倾向将活性污泥看作微生物生长繁殖的温床。此外，军团菌在除G-A/O外的其他三种系统活性污泥中浓度均高于进水中浓度，可见军团菌对活性污泥工艺有更好的适应性。然而，沙门氏菌在剩余污泥样品中均未检出，而部分出水中出现沙门氏菌浓度上升的现象。究其原因，可能一方面是由于在污水处理中，沙门氏菌主要分布在水相，很少进入活性污泥絮体之中；或者又从污泥絮体中分离出来，如Hendricks(Hendrick,1971)研究发现，近90%沙门氏菌可从人工湿地的基质和沉积物中分离出来，重新进入水体，进而在部分出水中出现浓度升高现象。另一方面，在活性污泥中，占优势的多是本土微生物，而沙门氏菌来源于肠道，数量本就不多，进入曝气池后，沙门氏菌在与其他数量巨大的细菌竞争中往往处于劣势，进而走向死亡；再者，由于原生动物的捕食作用(Curdsetal.,1982;Pillaietal.,1942)，使得沙门氏菌数量更低。此外，四种工艺对大肠杆菌、军团菌和沙门氏菌三种菌的去除效果也各不同。相较于其他三个工艺，G-A/O工艺对大肠杆菌和军团菌的处理效果较好。其对大肠杆菌和军团菌的四季平均去除效率最高，分别达99.88%和93.48%。然而，即便四个污水处理厂对大肠杆菌去除效率可达90%以上，大肠杆菌在出水中浓度依然较高，维持在104左右，甚至高达105copies/ml，可见二沉池出水中较高浓度的大肠杆菌对生态安全具有不可忽视的潜在危险。在Q-A2/O、W-SBR与G-A/O污水处理过程中，存在军团菌浓度升高的现象，尤其在W-SBR处理工艺中，军团菌浓度远高于进水浓度。据有关军团菌生长条件的研究（邵祝军,2005）发现，大量的污泥浓度、原生虫类和有机物含量均有助于军团菌的生长。而W-SBR其污水来源100%为生活污水，且系统中污泥浓度较高，有机物含量丰富，军团菌本身就具有很强的环境适应性，遇到人工创造的良好环境条件（曝气、有机质等）时，军团菌即得到大量繁殖和增生，从而表现出浓度反升的现象。而在J-OD氧化沟处理过程中，污泥中的军团菌数量较少，其原因可能是由于氧化沟污水处理工艺属延时曝气工艺，污泥龄较长，污泥稳定化程度高，其不利的环境条件和微生物竞争压力，导致军团菌活性降低，致使数量减少；然而在出水中军团菌浓度又出现升高，可能一方面因为军团菌具有较强生命力，另一方面，Kuchta等研究(Kuchtaetal.,1985)发现，军团菌由于没有相应的噬菌体，且与许多细菌和原虫存在共生关系，尤其是阿米巴等原生动物不仅可源源不断的为军团菌提供所需的营养，而且阿米巴可分泌出厚的囊壁包裹军团菌，从而可依附于生物膜或寄宿于原虫这些屏障之中。因而，军团菌可相应的减轻延时曝气工艺对其所造成的不利影响，待军团菌遇见合适的繁殖条件时，将再度“苏醒”并大量增殖，即病原菌的重新生长现象(Erdaletal.,2003；Iranpouretal.,2002)。正是因为军团菌对水处理工艺乃至消毒工艺所表现出的超强耐受性，若处理不当，军团菌可通过出水再次污染地表水，并形成气溶胶扩散到环境中，进而对公共健康和生态环境造成潜在威胁(Baertschetal.,2007)。另外，需要注意的是，由于细菌死亡后DNA仍可存留一定时间，利用DNA进行定量PCR定量的方法也可能会高估病原菌含量。综上所述，大肠杆菌和军团菌在污水处理厂的剩余污泥和出水中仍具有较大的生态和健康风险，应加强二沉池出水或中水回用的消毒强度；如果条件允许，应该适当布点增设病原菌的常规检测。尤其是军团菌在夏季出水中含量过高，宜在夏季加强对军团菌的监测预防。此外，沙门氏菌在冬季出水中浓度也相对较高，也应该引起足够重视。同时，更应加快对病原菌低成本、高效防治技术的研发，以减少病原菌的环境排放风险。

4结论（Conclusion）

（1）三种病原菌在北京市四个污水处理厂进水中分布主要以大肠杆菌（106-108copies/ml）为主，军团菌（104-105copies/ml）次之，而沙门氏菌（102-103copies/ml）最少。（2）大肠杆菌在污水处理系统中的分布具有一定的季节变化规律，其在夏季进水和出水中浓度最高，分别在107-108copies/ml和105copies/ml左右；而沙门氏菌和军团菌在污水中的分布并未表现出明显的季节性变化现象。（3）从四个污水处理系统对病原菌去除效率来看，以G-A/O对大肠杆菌的去除效率最高，其平均去除率可达99.88%；而各工艺系统并未对沙门氏菌和军团菌表现出明显的去除效果。（4）污水处理厂的出水和污泥排放仍存在一定的生态和健康风险。尽管大肠杆菌在四个污水处理系统的去除率均在90%以上，但大肠杆菌在出水和活性污泥中的浓度依然较高，其出水中浓度在103copies/ml以上，而在活性污泥中浓度更高，基本高达105copies/ml。军团菌在四个污水系统中的削减并不明显，甚至在W-SBR系统出现出水中浓度高于进水浓度现象，其平均进水浓度2.07×104copies/ml，而平均出水达4.33×104copies/ml，高出进水1倍；此外，军团菌在Q-A2/O、W-SBR和G-A/O系统的污泥样品中浓度则更高，其均在8.56×104copies/ml及以上，而W-SBR系统也尤为突出，其污泥中军团菌浓度相比于进水浓度升高约2个数量级，在106copies/ml以上。沙门氏菌在各污水处理系统进水中含量相对较低，在102-103copies/ml，但其在冬季出水中浓度也相对较高，基本在102copies/ml左右。

作者：易鑫李娟黄京刘新春单位：中国科学院大学资源与环境学院