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茶树CsANS基因的生物信息学分析

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《茶叶科学杂志》2016年第二期

摘要:

采用RACE技术,获得茶树武夷奇种C18叶片花青素合成途径中的花青素合成酶(ANS)基因的cDNA全长序列。采用染色体步移技术获得该基因的启动子序列。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同遮光处理下的表达动态。结果表明,CsANS全长cDNA为1000bp,其中ORF(OpenReadingFrame)为957bp,编码320个氨基酸,含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能结构域;分离得到CsANS基因上游调控序列1010bp,其含启动子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1(光响应元件)、circadian(生物钟相关元件)等与花青素合成途径相关的重要顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,该基因在全光照处理(CK)时表达量较高,75%遮光时表达量较低。说明该基因的表达受光照强弱的控制。

关键词:

茶树;CsANS基因;启动子;生物信息学分析

茶树武夷奇种C18,无性系。灌木型,中叶类,中生种。是福建省武夷山市茶叶研究所从武夷群体种中选育的优良品系。芽叶紫红色,茸毛较密,节稍长。且芽叶生育力强,发芽较密,持嫩性较强,是一种稀有的特色茶树资源。武夷奇种C18芽叶呈现红紫色,花青素含量较高[1-2]。研究表明,花青素是茶树叶片呈现“红紫色”的主要原因[3]。植物花青素的生物合成途径已有较为深入的研究,其中花青素合成酶(Anthocyaninsynthase,ANS)是将无色花青素经氧化脱水形成红紫色花青素的关键酶[1]。环境信号激活花青素合成途径中相关基因的表达[4]。在花青素合成的前期,光能调控相关基因的表达,弱光可以抑制或下调基因的表达,从而减少花青素的合成;而强光可以诱导花青素合成相关基因的表达,使花青素的含量增加[5]。光信号调控转录因子与启动子结合的强弱,并影响结构基因的表达,其表达量也会随之发生相应的变化[1]。目前在茶树上,ANS基因的启动子还未克隆。本研究根据已有的茶树ANS基因的EST(Expressedsequencetags)序列,采用同源克隆和GenomeWalking方法,克隆了紫叶茶树的ANS基因及分离5′调控序列,再利用生物信息学法,预测了启动子的顺式作用元件,采用荧光定量PCR技术,分析ANS在不同光照条件下的表达模式,有助于揭示ANS在紫色茶树叶片对环境信号响应过程中的作用,解析光强对武夷奇种C18ANS基因的调控机理,为紫芽茶树特异种质的创制和利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与处理1.1.1植物材料试验材料为武夷奇种C18,由福建省武夷山市茶叶研究所资源圃提供。选取武夷奇种C18的成熟叶片,迅速用液氮处理,置-80℃冰箱保存,用于基因组DNA的提取,克隆CsANS启动子序列。

1.1.2遮光处理试验在福建省武夷山市茶叶研究所资源圃中完成。2015年4月中旬,挑选生长发育良好、整齐一致、树形基本相似的植株27株,分为3组(每9株为1组,每重复3株),挂牌标记,并对其进行同一高度的修剪。待茶树芽头萌动之时,开始遮光处理。设2个处理:分别用75%和60%的黑色遮荫网遮光,以全光照处理为对照。经过15d的遮光处理,取经遮光处理和全光照处理(CK)的武夷奇种C18叶片(第一叶位),经锡箔纸分装于-80℃保存,用于荧光定量PCR检测。

1.1.3试剂FHPlantDNAKit(北京德曼特尔生物科技有限公司);PrimerStar(TaKaRa公司);AgaroSeGelDNAExtractionKit(TaKaRa公司);SMARTerRACE5′/3′Kit(TaKaRa公司);染色体步移试剂盒(TaKaRa公司);pEASY-BluntZeroCloningKit(福州都拜特生物技术有限公司);引物合成及样品测序由铂尚生物技术(上海)有限公司完成。

1.2方法

1.2.1茶树叶片总RNA及基因组DNA的提取本试验参照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取茶树总RNA;采用FHPlantDNAKit(北京德曼特尔生物科技有限公司)试剂盒提取紫叶茶树基因组DNA。

1.2.2茶树CsANS5′RACE、3′RACE及全长ORF的PCR扩增cDNA第一链的合成按RevertAidTMFirst-StrandcDNASynthesisKi试剂盒说明书进行。根据已报道的拟南芥、葡萄、茶树等ANS基因序列,用DNAMAN设计同源克隆引物。上游引物:5′-CAACAATGATGACTACAGTGGCTG-3′,下游引物:5′-GCGCCTTTAGAGCCAAGTTCTTG-3′。PCR扩增体系:12.5µLEx-Taqmix,2µLcDNA模板,0.5µLANS-R,0.5µLANS-F,补ddH2O至25µL体系。94℃预变性4min,94℃变性40s,56℃退火30s,72℃延伸3min,35个循环,最后72℃延伸10min进行PCR扩增。在其ORF两端设计特异引物qANS-R:5′-ATGGCTCTCTGTACATATGCATGTC-3′;qANS-F:5′-TTATACAATTGTTACACCCCCGGTC-3′扩增全长序列。

1.2.3CsANS基因启动子的克隆根据TaKaRaGenomeWalkingKit引物设计原则,在已知的茶树ANS基因(GenBank收录号为AY830416.1)的已知序列区(最好不少于500bp)分别设计3条反向且退火温度较高的特异性引物SP1、SP2和SP3,再与试剂盒中提供的4种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4进行热不对称PCR反应[6],经过3次巢式PCR反应获得已知序列的侧翼序列。用于扩增ANS基因启动子序列的特异性引物情况详见表1。以提取的武夷奇种C18茶树叶片DNA为模板,按照TaKaRaGenomeWalkingKit说明和林玉玲等[7]的方法进行ANS基因启动子的克隆。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,切下目的条带克隆至pMD18-T载体,37℃连接过夜后进行转化测序(铂尚生物技术有限公司)。

1.2.4荧光定量PCR表达分析分别提取遮光75%、60%和全光照处理(CK)的武夷奇种C18第一叶位总RNA,用逆转录试剂盒(TaKaRa)反转录成cDNA,稀释10倍作模板。以18S-rRNA基因为内参(18SⅠ:5′-CCTGAGAAACGGCTACCACA-3′,18SⅡ:5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3′)。运用DNAMAN软件,按照荧光定量PCR引物设计原则,设计荧光定量PCR引物(ANS-R:5′-GTTGCTGTAATAGGCGATGGTG-3′,ANS-F:5′-CCTGTTGGACTGTAATCTGCTAAG-3′)。参照SYBRPrimeScriptTMRT-PCRKit(TaKaRa)说明书,进行荧光定量PCR扩增体系:cDNA模板1µL,2×SYBRPremixEx-TaqTM5µL,上下游引物(10µmol•L-1)各0.2µL,用RNase-freeH2O补足至10µL。95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃复性34s,共40个循环。每份样品设3次重复。试验数据应用MicrosoftExcel2007软件,采用2-ΔΔCt法计算其相对表达量[8];应用SPSS软件对结果进行差异显著性分析。应用MicrosoftExcel2007软件作柱状图。

1.2.5生物信息学分析CsANS序列通过在线NCBI的Blast功能进行氨基酸序列同源性比较;通过Protparam软件对基因的分子量、等电点进行预测,初步分析目的基因的功能;通过TMHMM和TMPred软件进行蛋白质跨膜结构的预测;SignalP4.1进行信号肽预测;在线SOPMA预测蛋白质二级结构。ProtCompVersion9.0进行亚细胞定位预测。启动子序列通过在线PlantCAR[9]及Place软件[10]预测其顺式作用元件的种类、分布情况和生物学功能[11]。通过在线软件BDGP[12]预测转录起始位点及可能的核心启动子区域。

2结果与分析

2.1茶树CsANS基因cDNA全长克隆

2.1.1茶树CsANS基因PCR结果分析经PCR扩增回收测序及使用DNAman软件拼接获得CsANS基因全长序列1000bp(GenBank收录号为KT215319)。(图1)该序列包含1个完整的阅读框(15~977bp),编码320个氨基酸,该基因含有起始密码子ATG、终止密码子TAA,并含有保守功能结构域DIOX-N、20G-Fell-Oxy,属于DIOX-N和20G-Fell-Oxy超级家族。

2.1.2茶树CsANS基因的进化分析将武夷奇种C18茶树ANS基因的氨基酸序列与已知的茶树、高丛越橘(Vacciniumcorymbosum)、和甘薯(Ipomoeabatatas)等11种植物ANS基因的氨基酸序列进行同源进化树分析(图3)。发现所克隆的ANS蛋白与同属茶树ANS蛋白(登录号:AY830416.1)的一致性高达100%。与其他物种比较,发现茶树ANS蛋白在亲缘关系上与高丛越橘最近,同源性为78%。

2.1.3CsANS基因氨基酸生物信息学分析通过ProtParam软件对CsANS氨基酸进行基本信息分析可知,CsANS基因编码320个氨基酸;相对分子量36113.6kD;理论等电点pI为6.23;负电荷残基(Asp+Glu)为46个,正电荷残基(Arg+Lys)为43个;不稳定指数为41.05,属于不稳定蛋白;脂溶系数为:88.97,平均疏水性(GRAVY)为-0.397;分子式:C1626H2576N432O472S12,总原子数为5118,氨基酸组成中谷氨酸含量最高,占总氨基酸的10.3%;其次为甘氨酸,占6.9%,其他氨基酸占82.8%。利用在线软件TMHMMServerv.2.0工具预测CsANS蛋白的跨膜螺旋区,如图4显示,该蛋白不是膜蛋白,无跨膜螺旋区。使用TMpred预测也显示蛋白都分布在膜外,无跨膜蛋白。通过在线软件COILS对CsANS氨基酸预测,在CsANS蛋白的25个氨基酸左右预测到强超螺旋信号。经过SignalP-4.1预测信号肽显示,CsANS编码的氨基酸不含信号肽,不是分泌蛋白。对氨基酸的二级结构预测显示CsANS编码的氨基酸中α螺旋结构较多,有125个占所有氨基酸的39.06%,其次为无规则卷曲占31.87%,延伸链占17.81%,β折叠所占比例最低为11.25%。通过ProtCompVersion9.0软件进行亚细胞定位预测,其亚细胞定位在细胞质。

2.2CsANS基因启动子克隆

2.2.1CsANS基因启动子扩增结果以武夷奇种C18的DNA为模板,经3轮巢式PCR反应后,扩增到1条大于1000bp的目的片段(图5)。将该片段进行克隆、测序,结果显示,获得的片段实际长度为1236bp。序列经过分析整理后,以ATG为起始位点,得到茶树CsANS上游长度为1010bp的DNA序列。

2.2.2茶树CsANS启动子转录起始位点的预测经过启动子转录起始位点在线预测,茶树CsANS基因1010bp的5′端调控序列可能存在3处核心启动子区域,位于35~85、316~366、480~530bp,分值分别为0.96、1和0.88,可能的转录起始位点分别为G、C和T。此结果可推测位于316~366bp的序列很可能就是该基因真正的核心启动子区域,转录起始位点为位于第357bp的C(图6)。

2.2.3茶树CsANS基因启动子顺式元件分析启动子生物学功能的在线预测结果表明,CsANS基因启动子区域中,除了含有大量的核心启动子元件如CAAT-box和TATA-box之外,还存在多种顺式元件,如脱落酸相关元件ABRE,厌氧诱导相关的元件ARE,热应激反应相关元件HSE,昼夜控制调节元件circadian,低温应答元件LTR,光响应相关元件Sp1、ACE、I-box及MYB结合位点等(表2)。

2.3相对荧光定量PCR表达分析以18S-rRNA为内参,采用实时荧光定量PCR对不同遮光处理及未处理的武夷奇种C18叶片CsANS基因表达进行了分析,结果(图7)表明,其表达量在全光照处理(CK)时较高,75%遮光时较低。随着遮光度增加,呈现下调趋势。说明茶树叶片在光照强时花青素合成酶(ANS)表达量高,光照弱时表达量低。

3讨论

CsANS是紫叶茶树花青素合成的最后一个酶,也是将无色花青素经氧化脱水形成红紫色花青素的最关键酶,此中间产物进一步与3-O-葡萄糖基转移酶(3GT)偶联并且被传送到液泡中,形成显色的3-O-糖苷化花青苷[13],在植物色泽形成中具有重要作用[14]。ANS基因最初是利用转座子标签技术从玉米的A2突变体中鉴定和克隆得到[15],近年来在茶树(AY830416.1)、拟南芥(AT4G2288)、小麦(T.aestivum,AB247921)[16-17]等多种植物中也已经得到其克隆。本研究从武夷奇种C18中克隆得到了CsANS的cDNA全长序列,该基因编码的蛋白具有典型ANS蛋白的保守结构域:DIOX-N、20G-Fell-Oxy。DIOX-N(吗啡合成非血红素加氧酶的N-末端)是蛋白质与2-酮戊二酸/铁(Ⅱ)依赖性双加氧酶活性的高度保守的N-末端区域。2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶结构域由2-酮戊二酸和Fe(Ⅱ)-依赖的氧化酶超家族组成,该家族包括脯氨酰4-羟化酶α亚基的C末端。全酶由一个α2β2复合物组成,α亚基是其主要的活性位点。能够催化反应:前胶原L-脯氨酸+2-酮戊二酸+O2=前胶原反式-4-羟基-L-脯氨酸+琥珀酸+CO2[14]。与其他已知的ANS蛋白相比,CsANS编码的氨基酸具有较高的同源性,它与高丛越橘(JN654701.1)的同源性较高,一致性为78%。所以推断CsANS与高丛越橘中典型的花青苷元合成酶基因的生物学功能类似。环境信号激活花青素苷合成途径,并促使茶树叶片开始积累花青素[18-20]。

不同的外界环境因子下,叶色会随之改变。光照是影响花青素苷合成最重要的环境因子之一。Hong等[21]对茶树进行暗光处理后发现ANS基因表达水平下降。Rosati等[17]从连翘中克隆得到ANS基因,并证明在Forsythin的花瓣中由于缺少ANS基因,所以形成无花色素苷。结合实时荧光定量PCR数据可以看出:不同遮光处理及全光照处理的武夷奇种C18叶片中CsANS基因均有表达;全光照处理下,ANS基因表达量较高,75%遮光时较低,且遮光度增加,ANS基因表达量减少。这表明光照强时ANS基因表达量较高,光照弱时ANS基因表达量较低;CsANS基因对于武夷奇种C18叶片色泽形成过程可能起主要作用,推断与其基因的催化功能吻合。近年来ANS启动子在洋葱(AlliumcepaL.)、三色堇(Viola×wittrockianaGams.)、紫心甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]中已经得到克隆[22-24]。洋葱、紫心甘薯和三色堇的ANS启动子除含有多个CAAT-box、TATA-box等基本启动子元件外,还含有与MYB转录因子结合的元件,以及参与光响应、逆境、激素应答的顺式作用元件。这与本研究中武夷奇种C18的ANS启动子发现的顺式作用元件相符,说明不同植物间ANS基因功能类似。武夷奇种C18的ANS启动子中发现了6种与光反应调控有关的顺式作用元件,结合CsANS基因在不同光强下表达量的变化,可以推测ANS是个受光照调控的基因。ANS基因在其他物种中参与光反应的研究已有报道[25-26],而从启动子角度来研究这类基因功能还鲜有报道,本实验下一步可以构建ANS基因的启动子缺失载体,转化到植株中,通过光照处理研究该启动子是否为光诱导型启动子,确定启动子核心启动区,对光照调控ANS基因的原理加以阐释。

作者:金琦芳 陈志丹 孙威江 林馥茗 薛志慧 黄艳 唐秀华 单位:福建农林大学园艺学院 福建农林大学安溪茶学院 闽台特色作物病虫害生态防控协同创新中心

茶叶科学杂志责任编辑:杨雪    阅读:人次