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LAMP-HNB快速检测技术研究

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1材料与方法

1.1实验方法

1.1.1DNA模板的制备取1mL过夜培养的副溶血弧菌菌悬液,19830×g离心2min,弃上清,沉淀按照细菌基因组DNA提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司)说明,提取细菌基因组DNA。

1.1.2引物设计与合成以副溶血弧菌不耐热溶血素tlh为目标基因序列,根据引物在线设计软件设计PrimerExplorer4.0,在线设计一套LAMP引物,由宝生物工程(大连)有限公司合成,引物序列见表1。

1.2扩增体系

1.2.1LAMP-HNB扩增体系反应体系25µL:10×反应缓冲液(NewEnglandBiolabs)2.5µL,dNTPsMixture(TaKaRa)1.4mmol/L,外引物F3/B3各0.2µmol/L,内引物FIP/BIP各1.6µmol/L,MgS041.5µL,甜菜碱(Sigma)1mol/L,BstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs)8U,细菌DNA模板2µL,HNB1µL(反应浓度150µmol/L)[2],ddH2O补足至25µL,配置好混匀离心,于65℃温育60min,80℃灭活10min,产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳分析,同时肉眼观察反应体系的浊度和颜色变化。

1.2.2PCR扩增体系反应体系25µL:包括10×PCRBuffe2.5µL(TaKaRa),MgCl22µL(TaKaRa),dNTP2µL(TaKaRa),上下游引物F3/B3各50nmol/L,DNA模板2.5µL,TaqDNA聚合酶0.3µL(TaKaRa),ddH2O补齐25µL。反应程序:预变性95℃5min;95℃30s;58℃30s;72℃45s;30个循环,72℃延伸10min。扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.3特异性实验LAMP-HNB和PCR方法对4株副溶血弧菌菌株和14株非副溶血弧菌菌株进行扩增,观察实验结果。

1.4灵敏度实验

1.4.1基因组DNA灵敏度检测用试剂盒提取副溶血弧菌基因组DNA,用酶标仪测定OD值计算DNA浓度,10倍比例稀释DNA原液到10-1~10-9,同时进行LAMP-HNB和PCR反应。

1.4.2细菌纯培养物灵敏度检测取振荡过夜培养的副溶血弧菌菌液,平板稀释法计算菌液浓度,10倍比例稀释10-1~10-8,用LAMP-HNB法检测灵敏度,同时做PCR实验。

1.4.3人工污染副溶血弧菌食品检测取经国标方法检测不含副溶血弧菌的牡蛎样品25g加入到225mL的NaCl碱性蛋白胨水中,用拍击式均质机均质2min。取8mL均质液加入已知浓度为1.4×108~1.4×10CFU/mL浓度梯度的副溶血弧菌纯菌各2mL,各取1mL用试剂盒法提取DNA,提取DNA同时做LAMP检测和PCR检测。

1.5对市售海产品进行检测从市场中采购海产品,其中包括带鱼、鱿鱼、海蛎子、花蚬子和多春鱼等40份。采用无菌操作的方法取鱼肉、鱼内脏、贝肉和虾腹节肌肉等25g加入到225mL碱性蛋白胨水,均质,(36±1)℃培养12~18h,接种到TCBS琼脂上,挑选可疑菌落接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板,36(±1)℃培养18~24h,按照GB/T4789.7—2013要求进行革兰氏镜检、氧化酶实验、嗜盐性实验、氯化钠三糖铁实验等生化鉴定试验,同时取1mL菌液按照(1.2.1)所提的方法,按照细菌基因组DNA提取试剂盒要求提取DNA用于LAMP-HNB和PCR实验。

2结果与讨论

2.1LAMP检测方法的建立针对副溶血弧菌tlh基因设计特异性引物进行扩增,根据羟基萘酚蓝指示剂的显色原理,羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂,Mg2+与HNB结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色,随着反应的进行,Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀,羟基萘酚蓝失去了Mg2+使得体系颜色变为天蓝色,而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色,以此判断LAMP反应结果。如表2所示,LAMP-HNB发生扩增反应的反应管变为天蓝色,而未发生扩增反应的反应管仍保持紫罗兰色。如图1、2所示,LAMP反应产物在琼脂凝胶电泳上出现典型的LAMP反应阶梯状条带,肉眼观察反应管有较明显的沉淀出现,PCR方法观察反应结果在207bp处也有较明显的条带。

2.2特异性实验如表3、4和图3、4、5、6所示,4株副溶血弧菌菌株(1、2、3、14号反应管)LAMP和PCR反应均出现特异性扩增条带,LAMP-HNB体系颜色为天蓝色(1、2、3、14号反应管颜色为天蓝色),其他14株非副溶血弧菌(4~12、13、15~16号反应管)未出现特异性扩增条带,LAMP-HNB仍保持紫罗兰色(4~12、13、15~16号反应管颜色为紫罗兰色),反应有较强的特异性。

2.3灵敏度实验

2.3.1基因组DNA灵敏度副溶血弧菌基因组DNA浓度为5.45×106fg/μL,10倍比例稀释进行LAMP检测,如表5和图7、8所示,从反应管颜色变化和凝胶电泳图中可以判断,LAMP-HNB检测副溶血弧菌基因组DNA检测限约为109fg。用同样的基因组DNA进行PCR反应,当菌液浓度为5.45×103fg/μL时PCR反应不产生扩增条带。因此,LAMP-HNB检测副溶血弧菌纯培养物的最低检测限为PCR的100倍(1号空白反应管和9~11号反应管都为紫罗兰色,2~8号反应管为天蓝色)。

2.3.2副溶血弧菌纯培养物灵敏度采用平板菌落计数法得原菌液浓度为1.4×108cfu/mL,把原菌液进行10倍比例稀释,各稀释梯度的菌液提取DNA进行扩增反应,如表6和图9、10所示,LAMP-HNB发生扩增的反应体系颜色变为天蓝色,而未反应的则为紫罗兰色,LAMP-HNB方法检测灵敏度为140cfu/mL,LAMP产物凝胶电泳结果与LAMP-HNB相同,PCR检测方法的检测灵敏度为1.4×103cfu/mL(1号空白反应管和8、9号反应管都为紫罗兰色,2~7号反应管为天蓝色)。

2.3.3人工污染副溶血弧菌的食品检测人工污染副溶血弧菌的牡蛎样品中的菌液浓度为2.8×107~2.8×100CFU/mL。如表7和图16、17、18所示,人工污染副溶血弧菌的牡蛎样品LAMP方法的最低检出限为2.8×102CFU/mL,平行PCR方法的检出限为2.8×103CFU/mL。

2.4市售海产品的实际检测对市售海产品40份分别进行LAMP-HNB检测、PCR检测和国标方法检测。其中LAMP-HNB法检出15份为阳性,25份为阴性,PCR检出15份为阳性25份为阴性,国标方法检出15份为阳性25份为阴性,检出率为38%。其中贝类的感染率最高,高达47%。以国标方法为标准,LAMP-HNB方法的检出率符合率为100%。

3结论

LAMP-HNB方法用HNB判断反应结果,随着反应的进行,Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀,羟基萘酚蓝失去了镁离子使得体系颜色变为天蓝色,而未发生反应的体系则仍保持着紫罗兰色,以此判断LAMP反应结果。LAMP-HNB方法检测特异性强,对单增李斯特菌标准菌株等非副溶血弧菌的食源性致病菌行LAMP-HNB扩增反应,LAMP-HNB终反应体系为紫罗兰色,对副溶血弧菌标准菌株进行LAMP-HNB扩增反应,反应体系变为天蓝色,二者颜色差别明显,可以较为准确区分。LAMP-HNB方法检测灵敏度较高,对于基因组DNA的检测限约为108fg,细菌纯培养物检测限约为140cfu/mL,这与徐芊、程晓艳[4]等报道采用LAMP检测结果基本相符,同时低于祝孺刚、刘琦等报道的采用PCR检测结果。

LAMP反应过程产生大量的焦磷酸镁沉淀,可通过肉眼直接观察,但较为难断定。常用的判断LAMP反应结果等方法有浊度分析、凝胶电泳和染料等。但是浊度分析和凝胶电泳法需要高昂设备和繁琐操作程序,所以研究新型指示剂观察反应结果在近几年较为流行。现常用的染料主要有SYBRgreen、钙黄绿素和HNB等。HNB和钙黄绿素可以在LAMP反应前加入,有效的减少了反应污染的可能性,其它染料(如SYBRgreen)则需要在反应后加入,加重了污染的可能性,若通过反应前将指示剂滴加在盖上,反应后弹入等方法则操作不容易控制。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂,原理是镁离子与HNB结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色,随着反应的进行,Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀,羟基萘酚蓝失去了镁离子使得体系颜色变为天蓝色,而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色,以此判断LAMP反应结果。本实验在反应前加入1µL(反应浓度150µmol/L)HNB染料观察颜色变化判定反应结果,并同时将产物进行凝胶电泳,发现二者结果相同,此结果与聂凯等人报道的应用HNB检测甲型H1N1流感病毒,吕恒等人报道的应用HNB检测大肠埃希菌结果相同,证明HNB有较强的准确性。副溶血弧菌广泛的存在于海产品及沿海环境中,国内外的报道中副溶血弧菌的分离率高达68.12%和78.6%,不同类别的海产品感染率不同,其中贝类副溶血弧菌污染较为突出,最高可达75%,本文在几种海产品检验中也属贝类的感染率最高,可以达到50%。人们在购买海产品时要合理安排好贮藏温度和时间,防止交叉感染。在食用海产品时要尽量避免生食,要进行充分的热处理,隔夜的餐食食用前要充分加热,必要时可以加食醋调味杀菌。

作者:纪懿芳 胡文忠 姜爱丽 冯可 单位:大连工业大学 食品学院 大连民族学院 生命科学学院 大连理工大学 生命科学与技术学院

LAMP-HNB快速检测技术研究责任编辑:杨雪    阅读:人次
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