反相高效液相色谱法范文

鬼针草为菊科植物鬼针草属多种植物的全草，药材资源丰富，广泛分布于热带及温带地区，遍布全国各地，极易采集。根据文献报道，鬼针草属多种植物含有槲皮素成分［1］；槲皮素具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、镇痛、抗血小板聚集、扩张冠状动脉等作用［2～4］。《中国药典》尚未收载鬼针草药材的质量标准。《贵州中药材标准》收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.、鬼针草BidensbipinataLinn.的干燥全草，《湖南中药材标准》收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.的干燥地上部分，《甘肃中药材标准》1995年收载鬼针草BidensbipinataLinn.，《广西中药材标准》1990年收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.、白花鬼针草BidenspoilsaL.var.radiataSch.-Bip.的干燥全草，河南中药材标准1991年收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.、鬼针草BidensbipinataLinn.、金盏银盘Bidensbiternata(Lour.)Merr.EtSherff.的干燥全草，《上海中药材标准》收载鬼针草BidensbipinataLinn.（婆婆针）的干燥地上部分［5］。从国内地方标准收载情况可以看出全国各地均有广泛的应用，入药部位为全草或地上部分，本实验拟采用RP-HPLC法建立鬼针草属药材中槲皮素的含量测定方法并比较鬼针草不同药用部位和不同种中槲皮素的含量，为该类药材的传统入药部位是否正确和质量评价提供参考依据。

1仪器与材料

美国waters2695高效液相色谱仪，VWD检测器；鬼针草采自云南红河州、广西，经刘圆副教授和戴斌教授鉴定为菊科鬼针草属植物狼杷草BidenstriparticaLinn.，白花鬼针草BidenspilosaL.var.ratiataSch-Bip.，婆婆针BidensbipinataLinn.，三叶鬼针草BidenspilosaLinn.的干燥全草；槲皮素（批号081-9304，中国药品生物制品检定所，含量测定用）；甲醇为色谱纯；水为二次重蒸水；其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件KrosmasilC18柱（4.6mm×250mm，5μm），柱温30℃，流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液（41∶59），检测波长360nm，流速1ml·min-1。槲皮素峰可以达到基线分离，峰形对称，分离度好，按照槲皮素峰计，理论塔板数不应低于5000。见图1～8。

图1槲皮素对照品色谱图（略）

图2三叶鬼针草（云南产）根色谱图（略）

图3三叶鬼针草（云南产）茎色谱图（略）

图4三叶鬼针草（云南产）叶色谱图（略）

图5狼杷草色谱图（略）

图6白花鬼针草色谱图（略）

图7婆婆针色谱图（略）

图8三叶鬼针草色谱图（略）

2.2供试品溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇配置成0.04mg·ml-1的溶液。

2.2.2样品溶液的制备称取鬼针草药材粉末（过40目筛）约1.0g，精密称定，置圆底烧瓶中加入甲醇-25﹪盐酸溶液（4∶1）25ml，称定重量，加热回流1h，取出，冷却至室温，用上述混合溶液补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45μm的微孔滤膜，作为样品溶液。

2.3线性关系的考察分别精密量取上述对照品溶液0.5，2，4，8，20μl，在上述色谱条件下测定峰面积。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=3×106X-33404，R2=0.9999(n=5)。结果表明槲皮素在0.02～0.80μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。

2.4精密度实验精密吸取对照品溶（0.04mg·ml-1）10μl，重复进样6次，测得峰面积的RSD为0.97%（n=6）。结果表明精密度良好。

2.5稳定性实验精密量取样品溶液10μl，分别于0，2，4，6，8h测定。按照槲皮素对照品峰面积计算RSD为0.6%（n=6）。结果表明样品溶液在配制后8h内稳定。

2.6重复性实验取同一批样品溶液，精密称取6份，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定槲皮素的含量，RSD为1.6%（n=6），表明重复性良好。

2.7回收率实验精密称取9份已知含槲皮素量的药材粉末0.25g，依次加入低、中、高3种质量浓度槲皮素对照品溶液，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定。结果平均回收率为99.87%，RSD为0.9%（n=9）。

2.8样品含量测定按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按照“2.1”项下方法测定，不同部位测定结果见表1，不同种测定结果见表2。

表1三叶鬼针草不同部位中槲皮素的含量（略）

表2鬼针草属不同种中槲皮素的含量（略）

3讨论

实验曾考察了甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）；甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55）；甲醇-0.4%磷酸溶液（40∶60）；甲醇-0.4%磷酸溶液（41∶59）为流动相，流速1ml·min-1，柱温30℃，以KromasilC18柱（4.6mm×250mm，5μm）为分析柱。本实验以甲醇-0.4%磷酸溶液（41∶59）为流动相，槲皮素峰可以达到基线分离，峰形对称，分离度好。本法简便、准确、重复性好，可以作为控制鬼针草属药材质量的标准之一。

就化学成分槲皮素的角度考虑，不同部位以叶入药最好，其次是茎，因此建议鬼针草属药材以地上部分为好；就不同种而言，以白花鬼针草槲皮素含量最高，质量最好。