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雌二醇鼻腔喷雾剂大鼠体内药动学

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1仪器与试药

1.1仪器

日立L??7200高效液相色谱仪(日本);日立L??7485型荧光检测器(日本);81??2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)。

1.2试药

雌二醇(浙江医药股份有限公司仙居制药厂);乌拉坦(中国医药上海化学试剂公司);随机甲基化?拨陋不泛?精(randomlymethylatedβ??cyclodextrin,RAMEB,德国瓦克公司);壳聚糖(大连鑫蝶甲壳素有限公司);对羟基苯甲酸乙酯(沈阳市东兴试剂厂);苯扎氯铵(Sigma公司);甲醇(色谱纯,天津康科德试剂公司);其他试剂均为分析纯。

1.3动物

Wistar雄性大鼠(体质量220~250g),广东省医学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(粤)2003??002。

2方法

2.1样品的配制

2.1.1E2鼻腔喷雾剂的制备E2与RAMEB以1∶1的摩尔比制备包合物,壳聚糖的用量为1%,苯扎氯铵的用量为0.01%,氯化钠调节等渗,pH值在4.0~6.0之间。

2.1.2E2??RAMEB包合物溶液的制备称取适量的E2??RAMEB包合物溶解于生理盐水中,氯化钠调节等渗,即得。

2.1.3E270%乙醇溶液的制备称取E2原料药适量,将其溶于70%乙醇中即得。

2.1.4E2注射剂的制备称取适量的E2,将其溶解于注射用水配制的0.01%(质量浓度)RAMEB溶液中,即得。

2.2给药剂量的确定

按体表散热量折算,250g大鼠的剂量为60kg人用剂量的0.025倍,再根据鼻腔给药和静脉注射给药的差异性及在测定过程中的准确性,确定雌二醇鼻腔喷雾剂的给药剂量分别为0.16、0.48和1.60mg?kg-1,E2??RAMEB包合物生理盐水溶液、雌二醇乙醇溶液剂和静脉注射给药的剂量均为0.16mg?kg-1。

2.3给药方法及血浆样品的采集

2.3.1鼻腔给药方法及血浆样品的采集取雄性SD大鼠,体质量200~250g,腹腔注射1.2g?kg-1的乌拉坦使大鼠麻醉,固定,打开颈部,暴露气管与食管,取一段聚乙烯管插入气管以维持呼吸。再在颈总静脉上插管供取血用。用微量注射器前接一柔软PE管插入大鼠鼻孔约5mm,缓慢滴入药液。给药后立即结扎食管以防药液从鼻腔流失。给药后取血时间点为5、10、20、30、45、60、90、120、150、180min,每次取血0.4mL,8000r?min-1离心15min,取出上层血浆,-20℃冷冻保存。

2.3.2静脉给药方法及血浆样品的采集大鼠麻醉,剪开一侧腹股沟皮肤,暴露浅表股静脉,分离覆盖黏膜层,左手食指按住股静脉近心端,待股静脉充盈后,1mL注射器配4号针头,以30°角进行静脉穿刺,推注药液无阻力感,表明针头在血管中,继续缓慢推完药液,给药完毕后用干棉球压迫止血。眼眶取血。给药后取血时间点为5、10、20、30、45、60、90min,每次取血0.4mL,8000r?min-1离心15min,取出上层血浆,-20℃冷冻保存。

2.4RP??HPLC荧光法测定血浆中E2的浓度[5,6]

2.4.1色谱条件色谱柱为KromasilODSC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm,Zirchrom);流动相为乙腈?菜?(体积比40∶60),流速为1mL?min-1;荧光的激发波长为267nm,发射波长为302nm;检测温度为30℃。

2.4.2内标溶液的配制精密称取对羟基苯甲酸乙酯50mg,置50μL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,得内标储备液。用甲醇稀释为12.5μg?mL-1的内标溶液。

2.5血浆样品处理和测定方法

取全血约0.5mL,于8000r?min-1离心10min,精密量取血浆0.2μL,置刻度具塞试管中,用微量进样器加内标溶液5μL,旋涡振荡2min,再加入5mL乙醚,旋涡振荡5min,于3000r?min-1离心5min,吸取上层乙醚,40℃用氮气吹干,然后加入200μL甲醇溶解,每次进样50μL。以E2和内标峰面积比R=As/Ai(As为E2峰面积,Ai为内标峰面积)为定量依据,计算样品中E2的含量。

2.6样品稳定性试验

取大鼠空白血浆200μL,配制E2低、中、高3个浓度(浓度分别1.984、99.200和496.000ng?mL-1)的血浆样品,样品经液?惨禾崛〈?理后,室温(约20℃)下放置24h测定,以考察处理后的E2血浆样品在室温下的稳定性。每一浓度进行3样本分析。3个浓度下血浆样品中E2测定均值与加入值之间的相对误差(RE/%)分别为3.1%,2.1%和5.3%,表明血浆样品处理后在室温下至少可稳定存放24h。

同法配制低、中、高3个浓度(浓度分别1.984、99.200和496.000ng?mL-1)的血浆样品,经反复3次-20℃冷冻,室温溶解后,测定样品浓度,以考察样品在冷冻和冻融条件下的稳定性。每一浓度进行3样本分析。3个浓度下血浆样品中E2测定均值与加入值之间的相对误差(RE/%)分别-1.9%,-3.3%和1.6%,表明血浆样品在冷冻?踩谌苎?环3次试验中无明显降解。

2.7大鼠体内药物浓度?彩奔淝?线

大鼠鼻腔及静脉注射给予E2后的平均血药浓度对时间做图得药物浓度?彩奔淝?线;利用统计矩法对血浆药物浓度数据进行分析(Cmax和Tmax采用实测值)。

2.8绝对生物利用度

将各鼻腔给药组的血药浓度?彩奔淝?线下面积与静脉注射给药组的曲线下面积相比较,按下列公式得各鼻腔给药组E2的绝对生物利用度(F)。

F=AUC0→∞(i.n)/Xi.n.AUC0→∞(i.v.)/Xi.v.×100%

3结果

3.1大鼠体内药物浓度?彩奔淝?线

各样品大鼠鼻腔及静脉注射给予E2后的平均血药浓度?彩奔淝?线见图1-4。

3.2绝对生物利用度

计算各鼻腔给药组E2绝对生物利用度,结果见表1。

图1雌二醇鼻腔喷雾剂鼻腔给药后大鼠体内血药浓度?彩奔涔叵登?线图(略)

Figure1Plasmaconcentration??timecurvesinratsnasallyadministeredwithestradiolnasalsprayatthedosesof0.16,0.48,and1.60mg?kg-1

图2雌二醇环糊精包合物溶液鼻腔给药后大鼠体内血药浓度?彩奔涔叵登?线图(给药剂量:0.16mg?kg-1)(略)

Figure2Plasmaconcentration??timecurvesinratsnasallyadministeredwithestradiol??RAMEBsolutionatthedoseof0.16mg?kg-1

图3雌二醇乙醇溶液鼻腔给药后大鼠体内血药浓度?彩奔涔叵登?线图(给药剂量:0.16mg?kg-1)(略)

Figure3Plasmaconcentration??timecurvesinratsnasallyadministeredwithestradiol??ethanolsolutionatthedoseof0.16mg?kg-1

图4静脉注射雌二醇溶液后大鼠体内血药浓度?彩奔涔叵登?线图(给药剂量:0.16mg?kg-1)(略)

Figure4Plasmaconcentration??timecurvesinratsintra??venouslyinjectedwithestradiol??ethanolsolutionatthedoseof0.16mg?kg-1

表1鼻腔给药后各制剂的主要药动学参数(略)

br1Pharmacokineticparametersafternasaladministeredwithdifferentpreparationsofestradiol

由于E2鼻腔喷雾剂的体内过程复杂,药时曲线无法按现有的数学模型进行处理,因此,采用梯形法计算AUC,并经统计矩处理计算MRT等药动学参数。检验结果显示,E2鼻腔喷雾剂0.16mg?kg-1剂量组的Cmax与E2鼻腔喷雾剂1.60mg?kg-1剂量组和E2??RAMEB包合物溶液组之间差异有显著性,AUC与E2鼻腔喷雾剂0.48、1.60mg?kg-1剂量组和E2乙醇溶液剂组间差异有显著性(P<0.05)。经计算3个剂量组的E2鼻腔喷雾剂的绝对生物利用度分别为86.87%、65.83%和48.99%,E2??RAMEB包合物溶液组和E2乙醇溶液剂组的绝对生物利用度分别为56.44%和24.38%。E2鼻腔喷雾剂0.16和0.48mg?kg-1剂量组的绝对生物利用度均高于单独鼻腔给予E2??RAMEB包合物溶液,从而说明鼻腔给予E2鼻腔喷雾剂提高了E2鼻腔吸收的生物利用度。

4讨论

4.1动物模型的选择

选择合适的动物模型对于确定鼻腔给药后药物的有效性非常重要。大鼠等哺乳动物的嗅细胞散在分布于整个鼻腔中,与人体嗅黏膜分布于鼻腔顶部不同,并且嗅细胞数量多,嗅黏膜占鼻黏膜总表面积的比例也高于人体,所以大鼠鼻腔给药后的实验结果只能作为人体的一种参考。虽然不能直接将大鼠的研究数据推之于人,但可认为其转运趋势是一致的。

4.2研究方法的建立

大鼠鼻腔给药的研究方法是Harai等于1981年建立的[7]。为了将药物完全保留在鼻腔中,Harai等采用胶黏剂聚α?睬杌?丙烯酸酯封堵鼻腭通道,减少药物向口腔的清除。由于胶黏剂封堵鼻腭通道时易渗入大鼠鼻腔,瞬间黏合形成胶状膜,影响药物的鼻黏膜吸收,且对动物的损伤大,故本研究采用给药后立即结扎食管来代替胶黏剂封堵,操作简便且可有效防止药液吞咽。新晨范文网

4.3吸收结果的讨论

雌二醇的乙醇溶液鼻腔给药并没有观察到吸收相,其可能的原因是乙醇作为一种渗透促进剂能够显著的提高药物对于鼻腔黏膜的通透性,增加药物对于黏膜的透过速率;其次,鼻腔纤毛的摆动运动也会将一部分的药物清除;即在测定时间点前,药物已经达到了吸收的峰值,因此在第一个时间点开始并未观察到药物的吸收相。

【参考文献】

[1]GENAZZANIAR,GAMBACCIANIM.HRTinthethirdmillennium[J].Maturitas,2001,38(1):49-55.

[2]O′CONNELLMB.Pharmacokineticandpharmacologicvariationbetweendifferentestrogenproducts[J].JClinPharmacol,1995,35:18-24.

[3]FRASERDI,PARSONA,WHITEHEADMI,etal.Theoptimaldoseoforalnorethindroneacetateforadditiontotransdermalestradiol:amulticenterstudy[J].FertilSteril,1990,53:460-468.

[4]郑彩虹,梁文权.阴道内给药系统发展现状[J].中国现代应用化学杂志,2002,19(6):465-469.

[5]YOONY,WESTERHOFFP,SNYDERSA,etal.HPLC??fluorescencedetectionandadsorptionofbisphenolA,17β??estradiol,and17α??ethynylestradiolonpowderedactivatedcarbon[J].WaterRes,2003,37(14):3530-3537.

[6]ALKHARFYKM,FRYERF.Sensitiveliquidchromato??graphicmethodusingfluorescencedetectionforthedeterminationofestradiol3??and17??glucuronidesinratandhumanlivermicrosomalincubations:formationkinetics[J].JChromB,2002,774:33-38.

[7]HIRAIS,YASHIKIT,MIMAH.Effectofsurfactantsonthenasalabsorptionofinsulininrats[J].IntJPharm,1981,9:165-172.

雌二醇鼻腔喷雾剂大鼠体内药动学责任编辑:李老师    阅读:人次
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