基因治疗载体研究现状及前景范文

基因载体主要有病毒载体和非病毒载体。病毒载体的基因转运能力强,但其携带基因的大小数量有限,而且在临床应用上存在安全性问题(王海等.2006)。非病毒载体具有低毒、低免疫反应,外源基因随机整合率低且携带基因大小类型受限制等优点,已成为基因治疗中的热点和当前药剂学研究的前沿课题。随着人类基因组计划的完成和后基因组计划的实施,功能基因不断涌现。如何将所需的功能基因导入受体细胞是基因研究中的关键步骤,因此开发安全有效的基因传递载体成为了当前研究的重要工作之一。对于非病毒载体,其基因传递方法又可分为物理法(carrier-freegenedeliver-y)和化学法(syntheticgenedelivery)。因此,无论是基因载体还是传递方法的发展都将对基因治疗产生深远的影响。《JournalofGeneMedicine》对2008年在临床基因治疗中所用载体的类型和各期基因临床试验的情况进行了调查。该调查发现在载体材料的使用中,腺病毒载体占24·9%(367例),为各种载体之首,但进入III期临床试验的基因治疗占3·2%(47例)。也就是说在基因治疗的临床应用上,研究者变得更谨慎和小心,就目前基因治疗的状况而言,安全性,即致畸、致癌和致突变,靶向特异性及体内转染效率等问题,已成为基因治疗所遇到的瓶颈问题。因此,如何研制出安全有效的、生物相容性好的基因药物载体,如何提高非病毒性基因载体的靶向特异性和体内外转染效率,已经是迫在眉睫的关键问题。

1基因载体的种类

基因治疗载体可分两大类:病毒性载体和非病毒性载体。

2病毒性载体

病毒性载体如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、疱疹病毒等。逆转录病毒应用最早,研究也相当深入,目前仍被广泛应用。虽其经改造后去除了病原性,保留了高的基因转染效率,但因制备困难、目的基因容量小、靶向特异性差,以及自身免疫原性和生物安全性问题,限制了它们的应用。特别是1999年出现首例因使用腺病毒载体而致病人死亡的事件发生后美国许多科研机构已停止使用病毒类载体,重点转向非病毒类载体研究。

3非病毒载体的研究进展

理想的非病毒载体需要满足以下条件:(1)保护DNA不被细胞外DNA降解酶的降解;(2)携带DNA穿透细胞膜;(3)保护DNA在进入核前不被细胞内容酶体和酶等降解;(4)能有效将有活性的基因插入目的区;(5)可生物降解,从细胞中消除;(6)无细胞毒性[1]。目前非病毒基因载体的研究主要集中于以下几个方面:

3.1阳离子多聚物载体阳离子多聚物/DNA混合物称为polyplex。阳离子多聚物(polycation)可浓缩富含阴离子的DNA,然后粘附到细胞表面的硫酸粘多糖上,被细胞内吞进入细胞内,从而使质粒表达。报道的阳离子多聚物种类很多,如聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI),聚丙烯亚胺树突状物(polypropyleniminedendrimers),聚酰胺树突状物(poly-amidoaminedendrimer),多聚赖氨酸、多聚组氨酸、多聚精氨酸、鱼精蛋白、壳聚糖(chitosan)等以及上述聚合物的聚乙二醇修饰物。其中研究较早的是多聚赖氨酸,后来发现聚乙烯亚胺性能更佳,是目前研究的热点。PEI可抑制溶酶体,在吞噬泡酸性环境中质子化、正电荷增加,对DNA提供更大的保护作用,有利于质粒逃离吞噬泡[2]。PEI糖基化或聚乙二醇化增加了其生物兼容性,阳离子多聚物/DNA混合物经PEG修饰后,可形成囊泡状结构,屏蔽表面多余的正电荷,有利于体内应用。

3.2纳米颗粒载体纳米颗粒载体介导基因转染具有其他非病毒载体所没有的优势。首先,纳米颗粒在一定范围内的颗粒数目对细胞的生长及活性无明显影响,细胞毒性和遗传毒性较其他载体低很多;同时纳米载体不存在免疫原性,因而不会导致免疫反应的发生。其次,纳米颗粒传递基因的效率较高。很多纳米材料作为载体传递基因的效率与脂质体相当甚至高于脂质体。第三,由于自身体积小,纳米颗粒可以在血管中随血液循环,并可通过血脑屏障到达身体各组织中。最后,纳米颗粒在体内的循环时间明显长于普通大小的颗粒,在短时间内不会很快被吞噬细胞清除,从而可以延长与细胞的接触时间,提高转染效率。同时,纳米颗粒还可与DNA形成致密结构,使DNA不被核酸酶消化降解,有浓缩保护DNA的作用。目前研究较多的纳米粒主要有无机纳米粒(如磷酸钙、磁性氧化铁)、固体脂质纳米粒、可降解聚合物纳米粒(如PLA、PLGA)、天然高分子纳米粒(如壳聚糖及其衍生物)、有机硅纳米粒等。

3.3脂质体脂质体DNA复合物又称为lipoplexes。应用的转基因脂质体分阳性、中性脂质体、阴性脂质体以及pH-敏感的脂质体。阳性脂质体,体外应用较多,如商品化的Lipofec-tin。在脂质和DNA的复合物中加入少量多聚赖氨酸或鱼精蛋白复合物等可形成类似病毒样的颗粒,减少了复合物间的凝聚,增加了对DNA的结合力,提高了脂质体在体外的转染效率。阳离子脂质体结构一般包括疏水基团和氨基基团,增加分子中氨基基团的数目,以及增加氨基基团与疏水基团之间的距离有利于增加DNA的释放能力。阳离子脂质体与DNA形成的复合物颗粒大小从50nm到1um不等,体外细胞试验,大颗粒的转染效率优于小颗粒。脂质体经聚乙二醇(PEG)修饰后,可降低脂质体-DNA复合物颗粒之间的相互聚集,降低了与血液成分的相互作用,使脂质体DNA复合物颗粒由大颗粒变成小颗粒,同时不影响脂质体与细胞的亲和力,但体外试验,阳离子脂质体聚乙二醇化降低了转染效率[3]。另外,将脂质体与配体结合形成导向脂质体可增加转染效率,如叶酸导向的pH-敏感脂质体可用于叶酸受体表达增加的许多肿瘤细胞系[4],抗转铁蛋白受体单抗偶联的PEG化的中性脂质体包裹质粒,体内应用,可广泛转染外周组织和脑[5]。

脂质体是由磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊,其作为抗癌药物的载体对癌细胞,具有靶向性、无免疫原性、缓释时间长、毒副作用低及载药率高等优点。由于脂质体既能包封脂溶性药物,又能包封水溶性药物,在肿瘤治疗中显示出明显的优越性。近年来,国内外研究者在脂质体的制备工艺、表面修饰、靶向性等方面进行了广泛研究,前体脂质体、长循环脂质体、阳离子脂质体等新型脂质体不断涌现,为脂质体的临床应用开辟了广阔前景。前体脂质体是在普通脂质体制剂中加入一定量的固相载体,通过不同的干燥工艺使其形成动性较好,易在水中分散或溶解的粉末[6]。North等[7]用脂质体包裹肿瘤相关抗原BLP25制成肿瘤疫苗,用于治疗非小细胞肺癌和前列腺癌患者,延长了患者的存活时间。Richards等人[8]将脂质体包被的多柔比星(ADR)对胃癌患者进行瘤周黏膜下注射,与单独注射游离ADR比较,其在淋巴结内药物浓度明显提高,而且持续时间长、毒副作用小、抗癌疗效高。3·4聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)研究表明,PEI在体内外均有较高的转染效率,但是PEI不易被细胞内的酶代谢,易在核内聚集,引起细胞毒性。因此,需对PEI进行改性,使聚乙烯亚胺表面聚乙二醇化,即“PEGylation”,以减小其毒性。其中将聚乙二醇与聚乙烯亚胺共聚、聚乙二醇与聚乙烯亚胺偶合和聚乙二醇对聚乙烯亚胺进行物理包裹等都是可选择的策略。因为聚乙二醇的介入,使聚乙烯亚胺与DNA所形成的微粒在血液循环中稳定性增加,防止微粒在生理条件下聚集和沉淀。Thomas等用不同分子量的聚乙二醇偶合于PEI25kDa上,发现PEG在PEI所形成的微粒有不同的结构形式,如核壳结构(core-shellstructure)和均相结构(homogenous-s),其中均相结构微粒易被细胞吞噬。他们还将三元共聚化合物hy-PEI-g-PCL-b-PEG应用于基因药物的释放,该共聚物的特点是可生物降解[9]。Kim将半乳糖和聚乙烯亚胺通过活性聚乙二醇的“桥”连接起来,同时利用活性VS-PEG-NHS将RGD短肽键合于载体材料,偶合配体的聚乙烯亚胺在基因转染实验中均显示靶向细胞选择性[10]。

3·5生物相容性载体材料为解决基因载体材料生物相容性的问题,天然高分子生物材料如胶原、透明质酸、壳聚糖和海藻酸盐等被用于基因药物载体的研究。其中壳聚糖及其衍生物在基因载体系统的研究最为广泛。Leong等[11]将壳聚糖先与DNA形成复合物微粒,把聚乙二醇(NHS-PEG-MAL)偶合于复合物微粒上,将肿瘤细胞上具有靶向受体表达的转铁蛋白(transf-errin)偶合在复合物微粒上,形成一种组装式、靶向性的转基因药物载体,该组装式载体在HEK293细胞株上具有很高的转染效率。Chong等[12]将聚乙烯亚胺(25kDa)偶合于壳聚糖上制成母体材料,然后把靶向于肝细胞的半乳糖基键合于母体材料上,制成具有靶向肝细胞的基因药物载体。他们还将壳聚糖进行苷露糖化作为靶向于巨噬细胞的苷露糖受体,以作为鼻腔内免疫体的辅助释放系统。除壳聚糖外,植物多糖也是一类良好的载体材料。大量的药理试验证明,多糖类药物主要作用于免疫系统、血液系统和消化系统等。作为基因药物载体,多数植物多糖的结构本身不能与质粒DNA结合,因此需要用化学方法对植物多糖的结构进行修饰改性。由于植物多糖的糖苷环结构中带有丰富的羟基、羰基等,为载体本身的活化提供了可能性。Takeda[13]等报道了用天然裂褶多糖(schizophyllan,SPG)、聚乙烯亚胺和质粒DNA三元复合物在抗原递呈细胞上被细胞吞噬摄取的研究,用原子显微镜观察了细胞的吞噬过程,结果发现该复合物易被细胞吞噬,说明糖羟基的存在易使复合物在细胞膜表面黏附及摄取。环糊精(cyclodextrin,CyD)是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖,其中具有重要意义的是含有6、7、8个葡萄糖单元分子的A、B、C-环糊精。在基因药物载体中,由于其所具有的活泼羟基基团,可以与聚阳离子材料(聚赖氨酸、聚乙烯亚胺及树枝状高分子载体材料)结合,制成具有生物相容性、可生物降解的基因药物载体系统。Davis等[14]报道用分子量为25kDa的直线型和树枝状聚乙烯亚胺,分别偶合于经过活化的B-环糊精上,制得β-CyD-LPEI和β-CyD-bPEI,对所合成的载体材料进行体外细胞学实验和体内动物实验。我们课题组用B-环糊精上的活泼羟基,用N,N’-二羰基咪唑对环糊精进行修饰,将低分子量的聚乙烯亚胺偶合于B-环糊精上,得到了满意的体内外转染效率[15-17]。Li用B-环糊精为核,将聚乙二醇穿过B-环糊精的空穴,再将小分子的聚乙烯亚胺偶合于B-环糊精的表面羟基上,形成一个多功能的组合式基因药物载体,所合成的载体材料极易溶于水体系中,且有很强的DNA缩合能力,在HEK293细胞上表现出良好的转染效率[18]。同时,用低分子量的聚乙烯亚胺经N,N’-二羰基咪唑活化后,偶合于B-环糊精的7个羟基上,形成一个以B-环糊精为核、聚乙烯亚胺为侧基的树枝状聚合物,为B-环糊精-聚阳离子材料在基因药物的研究领域开创了新的方法。

3.6多功能信封式纳米载体(MEND)多功能信封式纳米载体(Multifunctionalenvelope-typenanodevice)[19]是由日本人Hi-deyoshiHarashima提出的基于程序组装的一种新型的复合载体系统。理想的MEND是由压缩的DNA核心和含有靶向因子及功能配体的脂质信封外壳构成。首先,采用多聚阳离子如PLL、PEI将DNA压缩,这样可以保护DNA不受核酸酶的降解,控制DNA复合物的大小及提高DNA的包封率。其次将多聚阳离子/DNA复合物通过与脂质体间的水合作用和静电相互作用包裹入脂质体中。最后对脂质体进行修饰达到不同的功能,如PEG化和靶向作用。这种新型的复合载体系统综合了各种载体系统所具有的优点,具有显著的促进基因的细胞转染潜在优势,因而有着广阔的发展前景。

4配体介导的靶向载体

要使非病毒载体能在肿瘤细胞或特异组织中定向迁移并携带DNA进行细胞转染,就需要在载体表面进行靶向基团修饰,使其具有靶向特异性。叶酸、转铁蛋白、半乳糖、TAT肽及胆甾醇等靶向配体偶合于载体上可以提高载体的靶向性。

4·1叶酸受体研究表明叶酸受体在大部分恶性肿瘤细胞表面均有过度表达。叶酸受体主要有α-FR、β-FR和γ-FR三种亚型,其中α-FR在卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌等一些上皮组织的恶性肿瘤细胞中高表达;β-FR在头颈部鳞状细胞癌及一些非上皮来源的癌组织中高表达;γ-FR分布很少,主要在血液组织出现恶变时有过度表达。叶酸受体的表达水平与肿瘤的发展阶段有关,早期肿瘤的叶酸受体表达较低,晚期及高度恶变的肿瘤受体表达增强。用壳聚糖为核心偶合聚乙二醇形成亲水性的载体材料,再将叶酸偶联于载体材料上,是一种有效改善壳聚糖性质的方法。Yang等报道壳聚糖经过聚乙二醇偶合后溶解性大为改善,再偶合叶酸配体后,该载体材料就成为一种具有一定靶向性的复合式基因载体[20]。

4.2转铁蛋白受体Wanger等将聚乙烯亚胺与转铁蛋白偶合制成Tf-PEI共聚物,对50种细胞进行了体外转染实验,发现Tf-PEI共聚物对10种肿瘤细胞的转染具有较高的选择性;同时,对动物进行了体内的研究,实验结果表明其在肿瘤组织中的表达明显高于其它组织器官。他们还用冷光共聚焦显微镜活体观察了Tf-PEI/DNA和Tf-PEG-PEI/DNA复合物在荷瘤小鼠中的分布及在肿瘤部位的迁移、富集,为非病毒基因载体材料在动物体内的研究奠定了基础[21]。

4.3短肽蛋白1988年Green和Franke研究小组[22]分别发现HIV-1的TAT短肽蛋白具有穿越细胞膜进入细胞的特性,随后一批能跨膜的短肽蛋白相继被发现,如Antp、VP22及Transportan等。这类具有穿膜功能的短肽被科学家统称为细胞膜穿透肽(cell-membranepeneratingpeptide,CPPs)。CPPs不但自身具有穿透细胞膜的能力,而且能够介导与其相连的各种载体材料跨膜进入细胞,这对于不能靠自身能力进入细胞的载体材料是个非常有意义的发现。因此,有许多课题组开展了短肽蛋白介导的穿膜体系研究,噬菌体展示技术已经筛选出许多具有靶向功能的短肽蛋白。Yang课题组将短肽TAT偶合于聚乙二醇-胆固醇载体材料上,形成双功能靶向载体TAT-PEG-b-Cho,l其中TAT序列NH2-YGRKKRR-QRRR,结合FITC技术和量子点技术发现,该组装式载体在肿瘤细胞具有极高的转染效率[23]。汤谷平课题组将TAT、MC10和CY11等功能性靶向短肽偶合于PEI-CD载体材料上,在体外细胞转染实验中显示出较强的肿瘤细胞选择性[24-26]。存在于性激素靶器官肿瘤,而且还存在于一些非性激素靶器官肿瘤,如肺癌、甲状腺腺瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、食管癌、胰腺癌、肝癌等。这就为以激素介导的基因药物治疗肿瘤及其他疾病提供了可能。Yang课题组用葵二酰氯(sebacoylchloride)和N-甲基二乙醇胺(N–methyldie-thanolamine)合成聚(N-甲基二乙醇胺葵酯)[poly(N-methyldiethanolaminesebacate)]。配体胆甾醇则用溴乙胺(bromoethylamine)与酰氯化的胆甾醇(cholesterylchloroformate)在三乙胺作用下,活化3位碳上带活性基团的胆甾醇,然后与上述两个化合物结合,形成以聚(N-甲基二乙醇胺葵酯)为骨架结构,胆甾醇为侧链配体的基因药物载体。在HEK293、HepG2、4T1、HeLa、MDA–MB-231细胞株及骨髓干细胞上均表现为低细胞毒性和高转染效率[27]。

5总结与展望

基因治疗的关键是获得有效进行基因传释的载体。病毒载体系统和非病毒载体系统均在深入研究,其目的是制备一个低免疫原性、有靶向性、无毒高效的基因治疗载体。从长远看,非病毒载体具有更好的临床应用前景,因为它具有靶向性、低免疫原性、低成本、易规模化等病毒载体所没有的显著优点,但是,非病毒载体的研究尚处于婴儿期,还存在着较多未解决的问题,例如,如何克服核膜障碍、如何降低血清成分干扰、长期应用是否存在安全性问题、如何提高通过受体获取靶向性的成功率、如何取得大量临床数据的支持等。因此,非病毒载体仍有待于随着基础科学的进一步研究而得到不断的发展。非病毒载体具有广阔的应用前景,但只有通过众多科研工作者的共同努力才能使其最终广泛用于基因治疗。