基因载体聚合物研究范文

非病毒基因载体聚合物以其低毒、低免疫原及靶向性等优点正成为目前基因治疗的热点之一。基因治疗是一种将外源基因导入目的细胞并有效表达从而达到治疗目的的方法,优良的基因传递系统要能包裹并保护核酸物质,避免内涵体降解,并能专一靶向机体的靶器官。载体问题一直是基因治疗研究领域的核心技术之一,基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒等[1],其优点是病原性低、转染率高,但其不仅价格昂贵,且易引发机体强烈的免疫反应并可能致癌,尤其是安全性低的缺点限制了其在临床的应用。非病毒载体的种类很多,如阳离子聚合物、阳离子多肽和阳离子脂质体等[2],具有价格低、制备简单、安全有效、无免疫原性等优点,已渐成为病毒类基因载体的替代者。本文从药剂学的角度综述近年来非病毒基因载体聚合物的研究现状,并探讨如何优化非病毒基因载体聚合物传递体系以提高基因治疗的疗效。

1非病毒基因载体的种类

1.1脂质体或脂质复合物

脂质体包括阳性、中性和阴性脂质体,其中阳性脂质体研究的最为广泛。自从1987年以来,众多学者相继合成出许多阳离子脂质体。所有的阳离子脂质体的一端皆拥有1~2条由12~18个碳原子组成的疏水链,使其在水性介质中形成双层结构,并包裹DNA;另一端为亲水性的N+,通过静电力与DNA结合以形成脂质复合物。构效关系研究表明[3],增加分子中N+数目以及N+与疏水链的距离,有利于基因转移。脂质体或脂质复合物经静脉注射后,很快被血浆清除并在肺组织中积蓄,蛋白质主要在肺内皮细胞中表达,通常表达时间较短,一般在给药后4~24h即达峰,1周后消失。因此,阳离子脂质载体在治疗一些肺部疾病如肺代谢性疾病、门脉高压和急性呼吸窘迫综合征等有较好前景。脂质体或脂质复合物也可直接应用于病变部位以避免静脉给药选择性差的缺点。有研究表明[4],气管内给予野生型Ad-p53凋亡诱导基因可促使肺泡上皮细胞中的半乳糖苷酶基因的表达使早期肺部肿瘤缩小,并且可有效地防止脂质复合物中DNA的降解。目前虽然在阳离子脂质体构效关系研究的基础上,合成了一些新的脂质载体,但离理想的脂质载体还相距较远,其主要困难在于体内外转染条件的差别,而且转染效果还取决于给药途径。因此,只有根据实际的临床应用来个性化设计才能获得较为理想的载体,这无疑给载体的开发带来困难。脂质体或脂质复合物并没有长期安全性报道。有动物实验表明[5],脂质体或脂质复合物是无毒的,而且若给予小剂量,其诱导的炎症反应很小;但当小鼠呼吸道吸入脂质复合物后,可诱导产生剂量依赖性的肺部炎症反应并伴随细胞因子的产生;若静脉注射给予DNA阳离子脂质复合物,则发现可激发细胞因子如INF和TNF产生。这些细胞因子不仅引发毒性,还抑制外源基因的表达,影响疗效。

1.2阳离子多聚物

1.2.1多聚赖氨酸聚-L-赖氨酸和去唾液酸糖蛋白连接的聚合物用于细胞的基因靶向转移,其基因转染效果较阳离子脂质体差。有研究表明[6],在有或无靶向配体的情况下,多聚赖氨酸与DNA的聚合物的细胞摄取率和基因转染率都依赖于聚合复合物正电性的存在。而将组氨酸连接到聚-L-赖氨酸的残基上形成的聚合物比添加了氯喹的聚-L-赖氨酸混合物更为有效,这可能是由于在pH<6的情况下,质子化的组氨酸提供了额外的内吞缓冲能力,因此,组氨酸的使用有助于避免DNA在吞噬细胞中被降解。此外,用半胱氨酸和色氨酸残基替代聚-L-赖氨酸中的一些氨基酸残基,会增强polyplexes的基因转染率,这说明DNA的释放可能受细胞内二巯键的还原所激发。虽然多聚赖氨酸像脂质体一样能阻止血清中核酶对DNA的降解,但若经静脉注射给药,聚合物与血浆蛋白结合后仍将迅速从血浆中被清除。

1.2.2聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)PEI阳离子聚合物表面的正电荷与DNA上带负电荷的磷酸基团产生静电作用形成复合物。电镜观察显示[7],复合物中的多数质粒DNA分子浓缩为孤立的环状结构,DNA的二级及三级结构发生了改变,但一级结构无变化,仍保留转录活性。这种复合物的超分子结构可以描述为一种核-壳结构,疏水核是部分中和的DNA,外壳则是亲水的阳离子聚合物链段。这种核-壳结构,增加了体系在血液循环中的稳定性,保护DNA在传递过程中不受DNA酶或巨噬细胞的降解。PEI阳离子聚合物由于其自身具有缓冲容量,在不需要加入吞噬细胞或溶酶体溶解剂的情况下就显示出较好的基因转染效果。PEI也具有细胞毒性作用,其毒性与相对分子质量(Mr)有关,不同Mr或异构体的PEI,在体内基因转染的效果和毒性不同[8]。目前,PEI已用于不同给药途径的基因转移如吸入、肾动脉内给药、脑内注射和静脉注射,如果在PEI的polyplexes偶联上靶向配体将会增强其转染能力。若用PEG包衣能使其在肺外组织、肝的基因表达增加,而且还能调节PEI的毒性,但是体外摄取有所降低[9]。而不论是静脉注射,还是气管内给药,线形PEI的基因表达皆优于阳离子脂质体。

1.2.3树突状聚合物树突状聚合物系一定Mr范围的聚酰胺和含磷树状聚合物的末端氨基通过静电力与DNA结合形成的一种阳离子多聚物非病毒基因载体[10],聚酰胺树状聚合物的酰胺键在水或乙醇中的水解,可使基因转染率增加50倍,其原因可能是水解增加了聚合物的柔韧性。故一些可水解的聚酰胺树状聚合物对体内颈动脉的基因转染比支链PEI更有效。Kurtoglu等[11]研究了树突状聚合物的载药特性,结果表明增加末端氨基的数目能增加聚合物基因转染的效果,并且还发现,水解的聚酰胺树状聚合物对吞噬细胞的膨胀作用至关重要。

1.3壳聚糖载体聚合物

壳聚糖作为一种天然阳离子聚合物,通过与DNA以静电方式作用使壳聚糖-DNA体系不被降解,完全进入细胞。作为基因载体,壳聚糖具有细胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和转染效率较高等特点[12]。研究者对壳聚糖-DNA复合物的制备及其生物活性进行了大量研究。壳聚糖-DNA复合物按制备方法主要分壳聚糖及其衍生物的DNA复合物、壳聚糖-DNA纳米微球和壳聚糖自聚体-DNA。有研究表明[13],壳聚糖的Mr、DNA复合物的N/P值、DNA复合物颗粒大小和对壳聚糖的改性及其改性程度是影响这类DNA复合物对细胞的转染效率和是否对特定细胞具有靶向性的主要因素。壳聚糖载体对质粒DNA有效的凝聚作用和保护DNA不被核酸酶降解是其它高分子载体无法比拟的。

1.4无机纳米粒子载体

应用于基因转运的无机纳米粒子主要包括硅、铁氧化物、碳纳米管、磷酸钙、金属纳米粒子、量子点等。无机纳米粒子主要通过穿过细胞膜将药物或生物分子转运到生物体中而起到治疗疾病的作用,其发挥转染功能的大致过程有:首先,将DNA和RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,通过内吞入胞等方式被转运至细胞内并且被释放。其次,将DNA导入细胞核并发挥功能。一般来说,分子都是通过核孔复合物进入细胞核。核孔复合物是一个插入到双层核膜中的蛋白质大分子,允许大约9nm的溶质自由通过。生物大分子或纳米粒子通过核孔则需要信号介导的转运分子。但目前没法确定DNA进入细胞核的确切途径,学者们主要倾向于两种主要理论:一种是纳米粒子在内涵体或细胞质中被溶解,然后释放DNA转运进核;另一种是携带DNA的纳米粒子直接到达细胞核表面,然后DNA转运进核。虽然无机纳米粒子的材料不同,但其具有浓缩及保护DNA的作用、较大的核酸装载容量、优良的表面性质、极低的免疫原性[14]都赋予了其在基因转染领域巨大的应用潜力。

2非病毒基因载体聚合物传递体系的优化

大多数非病毒基因传递系统的体外基因传递过程如下[15]:细胞内吞、脱离溶酶体、基因DNA进入细胞核。理想的非病毒基因载体聚合物传递体系能在体内循环系统中保持稳定,有效地到达靶向细胞,并实现在靶向细胞内的高效安全表达。通过对传递体系的优化,可提高其在体内循环中的稳定性、延长作用时间、减少细胞毒性及提高靶向性,从而提高基因传递体系的转染率。

2.1原位交联非病毒基因载体聚合物传递体系

在生理环境中,多数非病毒基因载体聚合物易聚集,很快从体内循环中清除,因而限制其应用。分子生物学的研究表明,病毒基因载体聚合物能保持稳定的原因为蛋白质大单体的交联。因此,可以通过聚阳离子交联制备非病毒基因载体聚合物传递体系,以提高其在盐溶液中的稳定性。对于两亲嵌段共聚物/DNA在水溶液中形成的胶束进入血液循环系统时,被高度稀释,如浓度降低到临界聚集浓度时,胶束就会解体。通过嵌段共聚物间的交联可有效抑制胶束的解体。PEG-b-PLL是最早采用戊二醛作为交联剂的体系,以戊二醛为交联剂,虽然提高了胶束的稳定性,但却增加了其毒性。Han等[16]则在PEG-b-PLL中引入-SH,通过-SH间的交联反应稳定胶束。这类原位交联的超分子组装基因载体极大地提高了基因传递体系在盐溶液中的稳定性。

2.2两亲性非病毒基因载体聚合物传递体系

绝大多数聚阳离子/DNA聚合物在生理环境下的溶解度很小,易沉析出来。通过在聚阳离子中引入亲水链段(如PEG)合成两亲嵌段或接枝共聚物,作为非病毒基因载体可有效地改善溶解性和细胞毒性问题。

两亲共聚物包括聚阳离子链段和非离子的亲水性链段。这类共聚物的合成通常采用两种方法,一是以端基功能化的亲水链段作为大分子引发剂,引发阳离子链段的聚合;二是聚阳离子链段和聚亲水链段的偶合反应。Wang等[17]采用前一种方法合成了一系列的两亲嵌段聚合物。非离子链段要求链段柔顺、低毒性以及低免疫原性,PEG最常被共价连接到阳离子聚合物上。由于PEG具有很强的水合作用,延长在血液循环中的时间,提高靶向细胞的吸收,且PEG链端也可引入各种功能基团,因而两亲嵌段聚合物是最常用的一类聚合物。聚阳离子链段的结构对基因转染效率有很大的影响,如电荷的密度、链的柔顺性以及疏水性都会影响与基因分子的作用,从而影响复合物的稳定以及解离。两亲共聚物/DNA聚合物的尺寸、结构及物理化学性质影响相关基因传递体系的体外、体内性质。ζ电位是关系到聚合物稳定性的一个重要参数[18],ζ电位与聚阳离子/DNA的比例有关。由于细胞膜表面为负电荷,ζ电位为正的基因传递体系,有利于细胞的内吞,因此在体外基因转染实验中,通常在阳离子聚合物过量的条件下制备基因传递体系。通过调节两亲共聚物的结构和基因载体的制备条件,就可获得有良好溶解性、稳定性及高基因转染率的两亲共聚物/DNA的非病毒基因载体聚合物。

2.3配体增强型非病毒基因载体聚合物传递体系在保证治疗基因作用的前提下尽量减少给药剂量,可避免很多不良反应。目前,提高基因传递体系的靶向性主要是通过在非病毒基因载体聚合物中引入与靶向细胞表面富含的受体或蛋白特异性结合的配体,制备配体增强型的非病毒基因载体聚合物传递体系。如半乳糖苷配体能与肝细胞膜表面的唾液酸糖蛋白受体特异性结合并介导内吞;而叶酸能与癌细胞表面的受体特异性识别,在基因治疗中常作为癌细胞的靶向配体。配体的引入有两种方法:一是采用分子偶联方法将配体共价键合到脂质体或阳离子聚合物上;二是在聚阳离子/DNA聚合物中引入含特异性配体的第三组分,使之作为涂层分布于基因传递体系的表面。蒋建伟等[19]将糖基共价连接到PEI中(Gal-PEI),从而使外源DNA导入肝细胞中并实现表达。但透射电镜显示在生理环境下,Gal-PEI/DNA聚合物易发生集聚,限制了其的应用。

3结语

目前,基因治疗已成为医药科研中最活跃的研究领域。药剂工作者的首要任务就是设计开发出无毒、高效的基因治疗载体。目前,非病毒基因载体聚合物以其低毒、低免疫原及靶向性等优点正在逐渐代替病毒基因载体,但基因转染率仍然较低,因此,设计既具有病毒的优点,又能克服病毒的细胞毒性和免疫原性人工病毒基因传递系统势在必行。未来的基因传递系统将被设计得更像病毒,具有多功能的基因载体聚合物。随着高效、安全、靶向的基因传递体系的研究开发,基因治疗必将得到越来越广泛的应用。