肝癌合并糖尿病诊断标志物的研究范文

【摘要】目的:筛选肝癌合并糖尿病的诊断分子标志，检测其在肝癌及糖尿病中的表达情况，为早期诊断肝癌合并糖尿病提供相应的分子标志物。方法:通过综合分析GEO及TCGA数据库筛选肝癌合并糖尿病的差异性分子，组织芯片上检测其在正常组织及肝癌组织的表达情况，ELISA检测其在糖尿病患者血清样品中的表达情况。收集临床血液标本，检测其在正常人、肝癌合并糖尿病、肝癌未合并糖尿病患者中的表达水平。继而在15例肝癌患者中，分析上述分子标志与血糖的相关性。结果:通过GEO及TCGA数据库筛选得到肝癌合并糖尿病的差异性基因CXCL14，组织芯片及ELISA结果表明CXCL14在肝癌患者及糖尿病患者中呈低表达。血液中CXCL14在肝癌合并糖尿病患者的表达水平明显低于肝癌未合并糖尿病组。肝癌患者中CX-CL14表达水平与血糖浓度呈负相关。结论:CXCL14可能与肝癌合并糖尿病的发生发展相关，早期检测肝癌患者血清中CXCL14的表达水平可能作为糖尿病的一个预测指标。

【关键词】肝癌;糖尿病;CXCL14

WHO统计表明，肝癌在恶性肿瘤发病及死亡原因中排列第三位，每年超过80万人死亡［1，2］，肝癌仍然是一个日益严重的全球健康问题。在中国，肝癌死亡率排列第二位，5年生存率仅为10．1%［3］。肝脏是维持血糖恒定的关键器官，肝糖原是血糖的重要来源。胃肠道吸收的糖30%～60%经肝脏处理并转化为糖原或氨基酸、脂肪酸，同时肝脏也是胰岛素作用的一个重要靶器官［4］。肝功能受损，可影响糖代谢而出现血糖的波动。肝脏的重要生理作用将肝病和糖尿病紧密联系在一起。相关研究显示，肿瘤患者中合并糖尿病的比率明显高于普通人群中合并糖尿病的比率［5，6］。16890例临床肿瘤患者在初次诊断时患糖尿病，胰腺癌、肾癌、结直肠癌、肝癌患者中糖尿病患病率较高，依次为18．76%、16．76%、12．34%、10．71%，并且肿瘤分期较晚。合并糖尿病的肿瘤患者总体死亡率明显高于未合并糖尿病患者，其中位生存时间，3年生存率均明显低于未合并糖尿病患者［7］。所以寻找相关分子标志物早期预测肝癌合并糖尿病，具有重要的临床意义。近年来，随着基因组学、转录组学等系统生物学方法的大量普及，国外已建立多个肿瘤临床标本资料、基因表达、基因突变等数据库，如GEO，TCGA等［8，9］。R语言为开放的编程平台，为海量数据的提取、统计分析及数据的可视化等提供了可能［10］。以上数据库含有丰富的临床标本及完备的临床资料，为我们研究肿瘤相关分子标志物奠定了充分的数据基础。

1材料和方法

1．1材料

肝癌组织芯片微阵列(XT16－011)购买自上海芯超生物科技有限公司。CXCL14抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。人胸肾表达趋化因子(BRAK/CXCL14)ELISA试剂盒(EME－H6609)购买自KITZOME(中国深圳)。免疫组化试剂盒购买自碧云天生物技术有限公司(中国上海)。

1．2差异基因的筛选

从GEO及TCGA数据库中获得测序数据并检索相关的研究。数据集搜索仅限于英语，并在2016年11月结束。使用网格术语和自由词增加搜索的敏感性。搜索词包括“正常”;“糖尿病”;“肝癌”;“组织”;“肿瘤”或“瘤”或“癌症”或“癌”。下载包含正常肝组织和肝癌组织的三个GEO数据集(GSE46408，GSE60502，GSE46444)。通过Perl语言集成“系列矩阵文件”及其相应的平台文件，创建一个包含基因标志及其在每个样本中的相应表达的新文件。随后通过limma文库的R语言分析正常组和肝癌组中的差异基因。从TCGA数据库下载TCGA－LIHC项目文件，包括374例肝癌组织和50例正常肝组织。通过Perl语言集成“转录组分析”;“基因表达定量”;“RNA测序”;“HT测序－计数”以创建一个新文件，包含基因标志及其在每个样本中的相应表达。随后通过edgeR文库的R语言分析正常组和肝癌组中的差异基因。通过维恩图展示GEO及TCGA数据库中分析得到的常见差异性基因。

1．3免疫组化染色

CXCL14抗体(1∶200)用于免疫组化检测组织中CX-CL14的表达情况。实验步骤详见参考文献［11］。使用Olym-pusBX51显微镜获得所有图像。使用半定量评分方法评价免疫组化染色，两名病理学家独立按照染色强度对CXCL14染色进行评分:无染色0分，浅阳性染色1分，中阳性染色2分，强阳性染色3分。阳性染色面积评分为:＜5%0分，5%～25%1分，26%～50%2分，51%～75%3分，＞75%4分。将强度分数乘以表达分数来计算最终分数，评分从0分到12分［11］。

1．4ELISA(酶联免疫吸附实验)

经成都医学院伦理委员会审议批准，患者签署知情同意书，于成都医学院肿瘤科收集肝癌合并糖尿病患者血液标本27例(其中12例用于检测CXCL14表达情况并与正常组、肝癌未合并糖尿病组相比较，15例用于检测CXCL14表达水平与血糖的关系)，肝癌未合并糖尿病患者血液标本12例，体检正常人血液标本12例。纳入标准:术后病理明确诊断为肝癌;有典型糖尿病症状(多尿、多饮和不能解释的体重下降)者，任意血糖≥11．1mmol/L或空腹血糖(FPG)≥7．0mmol/L，为糖尿病患者;FPG＜6．11mmol/L并且餐后2h血糖＜7．8mmol/L，为正常。排除标准:术前行放化疗患者;合并全身疾病或其他原发性肿瘤患者。详细记录患者的性别，年龄，病理分期分级等病理资料。将收集的血清样本储存在－80℃直至进一步使用。使用ELISA试剂盒(KITZOME，中国深圳)根据制造商的说明书测量血清中CXCL14的水平并定量，每个血清样本分析三次。

1．5统计学分析

所有统计分析均使用GraphPad5．0软件完成。定量资料均以均数±标准差(x珋±s)描述，组间比较采用t检验。至少进行三次独立实验。多组间的比较采用单因素方差分析(OneWayANOVA)检验进行分析。检验水准α除特别说明外均设定为0．05。

2结果

2．1肝癌合并糖尿病分子标志物的筛选

综合分析肝癌GEO及TCGA数据库，选择含有正常肝组织和肝癌组织的三个GEO数据集(GSE46408，GSE60502，GSE46444)和TCGA－LIHC。维恩图显示这四个数据集之间含有21个共同差异性基因(图1A，B)。选择含有正常组织及糖尿病组织的两个GEO数据集(GSE7014，GSE29221)，维恩图显示这两个数据集之间有137个共同差异性基因(图1C)。将上述筛选出的21个肝癌差异性基因与137个糖尿病差异性基因进行统计分析，维恩图显示肝癌与糖尿病共同差异性基因只有一个(图1D)。由此我们得到肝癌合并糖尿病的共同差异性基因CXCL14。随后，根据荧光强度半定量检测CXCL14在以上六个数据集中的表达情况，GSE46408(P=0．0004)，GSE60502(P＜0．0001)，GSE46444(P＜0．0001)，TCGA－LIHC(P＜0．0001)，GSE7014(P=0．0090)，GSE29221(P=0．0015)(图2)。与正常组相比，肝癌组及糖尿病组中CXCL14表达明显降低。

2．2CXCL14在组织芯片和血清中的表达情况

为了确定肝癌患者中CXCL14表达的临床意义，我们进行了免疫组化染色(图3A)，通过半定量评分方法测量CX-CL14的表达水平。结果显示肝癌组织中CXCL14的表达明显低于正常肝组织(P=0．0002)(图3B)。进一步分析CXCL14在血清中的表达情况，与正常血清相比，肝癌患者血清中CXCL14下调(P=0．0192)，糖尿病患者血清中CXCL14表达水平明显降低(P=0．0063)(图3C)。

2．3CXCL14在肝癌合并糖尿病患者中的表达情况

收集正常组，肝癌合并糖尿病组，肝癌未合并糖尿病组血清标本各12例，结果显示肝癌合并糖尿病患者血清中CXCL14表达明显低于肝癌未合并糖尿病组，组间分析P＜0．0001(图4A)，三组间具有明显差异。检测15例肝癌患者血清中CXCL14的表达情况，及对应的空腹血糖水平。相关性分析显示，CXCL14表达越低，血糖水平越高，相关系数r=0．9005，P＜0．0001，CX-CL14表达水平与血糖浓度呈负相关，具有统计学意义。

3讨论

随着生活方式的改变，糖尿病已经成为仅次于恶性肿瘤、心脑血管疾病后，危害人类健康的第三大疾病，其发病率与死亡率呈逐年上升趋势。在2013年，世界人群范围中已有3．82亿人患有糖尿病，预计到2035年将增加到5．92亿［12］。Yancik等临床研究证实，在校正年龄和分期后，合并糖尿病的乳腺癌患者30个月内死亡率要比未合并糖尿病患者高76%［13］。同时另一项临床研究表明，在校正年龄、性别、分期后，合并糖尿病的结肠癌患者死亡率增加37%［14］。Meyerhardt等进行的一项随机辅助化疗临床资料同样证实，合并糖尿病的287例结肠癌患者死亡危险率增加42%，肿瘤复发率增加21%［15］。所以寻找相关分子标志物，对于早期预测肝癌合并糖尿病具有重要的临床意义。目前认为CXCL14是一种肿瘤抑制基因，其蛋白的表达缺失与肿瘤发生发展有关［16，17］。正常肝脏组织中CXCL14高表达，肝癌组织中CXCL14的表达显著下调［18］。研究表明，过表达CXCL14能抑制肝癌细胞的增殖，引起细胞凋亡，抑制细胞的侵袭作用。

慢病毒上调CXCL14的表达，能明显抑制裸鼠的皮下瘤体生长。上调或重新过表达CXCL14对肝细胞癌的治疗具有重要意义［19］。此外，CXCL14可增强胰岛素诱导的胰岛素受体和胰岛素受体底物的酪氨酸磷酸化［20，21］。由此可见，肝癌患者血清中CXCL14表达降低，CX-CL14的下调可减弱胰岛素受体和胰岛素受体底物的酪氨酸磷酸化，降低胰岛素敏感性，从而增加患糖尿病的风险。而糖尿病患者血清中CXCL14表达进一步降低，加剧肝癌的进程，进而形成恶性循环，增加患者的死亡率。因此CXCL14的表达水平在肝癌合并糖尿病患者中起重要作用。综上所述，我们通过GEO及TCGA数据库检索分析，筛选得到肝癌合并糖尿病差异性基因:CXCL14，早期检测肝癌患者血清中CXCL14的表达水平可能作为糖尿病的一个预测指标。但相应的细胞及动物层面的分子机制仍需深入研究，为其临床转化奠定相应的分子基础。同时，CXCL14作为新型肝癌合并糖尿病分子标志物，其参考值范围及检测方法也需进一步研究。

作者：张婷；吴东明；许颖