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口腔扁平苔藓
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摘要目的摘要:探索口腔扁平苔藓(OLP)中Caspase3,TNFα和TNFRΙ的表达意义及其和细胞凋亡的关系.方法摘要:采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记法(TUNEL法)、SP免疫组化方法检测33例OLP及7例正常口腔黏膜(对照组)中Caspase3,TNFα和TNFRΙ的表达及细胞凋亡情况.结果摘要:OLP中上皮细胞凋亡指数(AI)明显高于正常对照组(P%26lt;0.05),而固有层的AI明显低于正常对照组(P%26lt;0.05).OLP的上皮层和固有层Caspase3阳性表达明显高于正常对照组(P%26lt;0.025).OLP中上皮层TNFRI及固有层TNFα阳性表达明显高于正常对照组(P%26lt;0.025),而上皮层TNFα及固有层TNFRI阳性表达则明显低于正常对照组(P%26lt;0.025),糜烂型组固有层中TNFα阳性表达明显高于非糜烂型组(P%26lt;0.05).OLP上皮层Caspase3阳性表达和其自身AI呈正相关(r=0.631,P%26lt;0.05),而固有层淋巴细胞Caspase3阳性表达和自身的AI无相关性(P%26gt;0.05);TNFα/TNFRI表达和OLP上皮及固有层细胞的AI密切相关.结论摘要:OLP中同时存在角质细胞凋亡亢进及固有层淋巴细胞凋亡的减少,这种凋亡的异常可能和OLP的发生发展密切相关.

【扁平苔癣,口腔;Caspase3;肿瘤坏死因子;TNFRΙ;细胞凋亡

0引言

口腔扁平苔藓(orallichenplanus,OLP)是临床上常见的口腔黏膜非感染性疾病,在临床上主要表现为口腔黏膜的白色斑块或条纹,其病理特征为上皮下固有层淋巴细胞带状浸润及基底层细胞液化变性.OLP的发病机制尚无定论.近期探究表明,OLP为细胞介导的自身免疫性疾病,且和细胞凋亡异常相关[1].我们通过原位检测OLP中Caspase3,TNFα和TNFRΙ蛋白的表达及细胞凋亡情况,探索Caspase3,TNFα和TNFRΙ在OLP发生发展中的功能及其和细胞凋亡的关系.

1对象和方法

1.1对象收集广州暨南大学第一附属医院及广东省口腔医院2001/2004年间口腔门诊OLP患者活检标本33(男7,女26)例,均是2mo内未经激光、激素、免疫调节治疗的原发病例.患者年龄22~71(平均45)岁.16例取自舌部黏膜,14例取自颊黏膜,3例取自下唇黏膜.非糜烂型24例,糜烂型9例.另取7例因口腔外伤或整形手术切除的正常黏膜作为对照组.根据临床表现结合HE染色,按WHO的OLP病理诊断标准,由两位临床病理医师分别独立诊断,以两人一致的结果为最终判定.根据临床表现结合病理诊断,将33例OLP分为2组摘要:糜烂型9例,非糜烂型24例.试剂摘要:小鼠抗人Caspase3mAb(浓缩型)购自NeoMarkers公司,工作浓度是1∶50.小鼠抗人TNFα和TNFRImAb(浓缩型)购自SantaCruz公司,工作浓度分别是1∶400及1∶100.TUNEL试剂盒为基因公司产品.SP试剂盒、DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发公司.

1.2方法患者活检标本4μm厚连续石蜡切片,65℃烘烤,脱蜡、水化后微波修复抗原,免疫组化SP法检测目标抗原,从33例OLP中随机选取15例(将33例随机编号,取偶数,末例舍去),TUNEL法原位检测15例OLP和全部正常黏膜的凋亡细胞.SP法操作步骤严格按照SP试剂盒说明书进行,DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片,PBS代替一抗作为替代对照,用已知阳性片做阳性对照.TUNEL法操作步骤严格按照试剂盒说明书进行,DAB显色,PBS替代TUNEL反应液作替代对照.

1.2.1免疫组织化学染色Caspase3阳性染色为细胞质或(和)细胞核内棕黄色颗粒着色,TNFα和TNFRΙ阳性染色均为细胞质中棕黄色颗粒着色.随机选择5个高倍视野(×400),计数阳性细胞所占的百分比.根据阳性细胞的比例记分摘要:阳性细胞比例为0,记为0分;1%~25%,记为1分;26%~50%,记为2分;%26gt;50%,记为3分.

1.2.2凋亡细胞的原位检测细胞核呈棕褐色或细胞质因核DNA逸出至阳性染色者,为凋亡细胞,随机选择5个高倍视野(×400),计数凋亡细胞数百分率,即为凋亡指数(apoptosisindex,AI).

统计学处理摘要:全部数据用SPSS10.0统计软件进行分析,Caspase3,TNFα和TNFRΙ的表达结果采用非参数等级资料秩和检验MannWhitneyTest,检验水准取双侧α=0.025(因涉及2次重复比较新问题,故调整检验水准,α=α/2,α取0.05).TUNEL法实验结果采用两样本均数比较的t检验.AI和Caspase3,TNFα和TNFRΙ表达的相关性及TNFα和TNFRΙ之间表达的相关性,采用Spearman等级相关分析.

2结果

2.1细胞凋亡情况在口腔黏膜上皮层及固有层均可见凋亡细胞,核呈棕褐色,轮廓清楚、致密.经两样本均数比较的t检验(经方差齐性检验,各组间总体方差齐同),OLP中上皮细胞凋亡指数明显高于正常对照组(P%26lt;0.05),凋亡细胞多位于基底层或基底上层,而正常对照组中的凋亡细胞多位于表层及棘层.口腔扁平苔藓中固有层的细胞凋亡指数明显低于正常对照组(P%26lt;0.05),凋亡细胞多位于固有层深层(图1A,表1).

表1口腔扁平苔藓和正常对照组中细胞凋亡指数的比较(略)

aP%26lt;0.05vs正常黏膜组.

2.2Caspase3表达情况OLP中Caspase3的阳性率上皮层和固有层均为100%,上皮层主要表达于基底细胞和棘细胞的胞质,亦可见胞核着色,基底细胞层及近基底细胞层阳性细胞为中度阳性表达,棘细胞层阳性细胞为弱阳性表达(图1B);固有层近基底膜的淋巴细胞和部分炎性细胞胞质和胞核均呈强阳性或中度表达.正常组上皮层阳性率为100%,均为弱表达;固有层阳性率为28.6%(2/7),为个别细胞弱阳性表达.和正常组相比,OLP患者上皮层角化细胞和固有层淋巴细胞表达Caspase3明显增强(P%26lt;0.025,表2).

表2口腔扁平苔藓和正常对照组中Caspase3的表达水平(略)

aP%26lt;0.025vs正常黏膜组.上皮层,固有层分别指上皮层角化细胞和固有层淋巴细胞.

2.3TNFα和TNFRΙ表达情况OLP的TNFα阳性表达率是75.8%(25/33),其中上皮层和固有层都有表达者14例,仅上皮层表达者3例,仅固有层表达者8例,但上皮层和固有层的阳性表达率各有不同.OLP组TNFα的上皮层阳性表达率51.5%(17/33)明显低于正常对照组的阳性表达率100%(7/7)(P%26lt;0.025),而OLP组的TNFα固有层的阳性表达率66.7%(22/33)明显高于正常对照组的阳性表达率0.0%(0/7)(P%26lt;0.025),糜烂型组固有层中TNFα表达明显高于非糜烂型组(P%26lt;0.05,表3).TNFα阳性染色主要弥漫分布于胞质,阳性细胞呈弥散性分布.上皮层阳性细胞主要分布于基底层及棘层(图1C).固有层中主要是围绕上皮钉突浸润的淋巴细胞呈阳性表达,大多数正常对照组上皮层细胞中TNFα强阳性表达,而固有层细胞中无表达.

OLP中TNFRI的阳性表达率是48.5%(16/33),其中上皮层和固有层都有表达者为9例,仅上皮层有表达者6例,仅固有层有表达者1例,但上皮层和固有层的阳性表达率各有不同.OLP组的TNFRI的上皮层阳性表达率45.5%(15/33)明显高于正常对照组的0.0%(0/7)(P%26lt;0.025),而固有层阳性表达率30.3%(10/33)明显低于正常对照组的85.7%(6/7)(P%26lt;0.025,表3).TNFRI阳性染色主要定位于细胞质,阳性细胞局限于上皮基底层,呈带状分布;固有层的淋巴细胞呈阳性,散在分布(图1D).

表3口腔扁平苔藓和正常对照组中的TNFα和TNFRΙ的表达水平(略)

aP%26lt;0.025vs正常黏膜组,bP%26lt;0.05vs非糜烂型组.

2.4OLP中Caspase3,TNFα和TNFRΙ的表达和细胞凋亡的关系OLP上皮细胞Caspase3阳性表达强弱和上皮细胞的AI呈正相关(r=0.631,P%26lt;0.05),固有层淋巴细胞Caspase3的阳性表达强弱和其自身的AI无相关性(P%26gt;0.05).TNFα/TNFRI和OLP上皮层及固有层细胞的AI有相关性,SpearmanA摘要:口腔扁平苔藓中固有层淋巴细胞中可见胞核被染成棕黄色的凋亡细胞TUNEL×400;B摘要:口腔扁平苔藓上皮层基底细胞Caspase3表达阳性SP×400;C摘要:口腔扁平苔藓上皮细胞胞质TNFα阳性表达SP×400;D摘要:口腔扁平苔藓固有层淋巴细胞胞质TNFRI阳性表达SP×400.

图1口腔扁平苔藓中TUNEL法阳性染色及Caspase3,TNFα和TNFRI蛋白的阳性表达(略)

等级相关分析显示OLP固有层淋巴细胞TNFα阳性表达和上皮细胞的AI呈正相关(r=0.971,P%26lt;0.05),和其自身的凋亡则呈负相关(r=-0.533,P%26lt;0.05).OLP上皮细胞TNFRI阳性表达和上皮细胞的AI呈正相关(r=0.583,P%26lt;0.05);固有层淋巴细胞TNFRI阳性表达和其自身的AI呈正相关(r=0.699,P%26lt;0.05).

3讨论

OLP为细胞介导的自身免疫性疾病,病变的发生发展和细胞凋亡异常相关[1].本实验结果显示,OLP上皮细胞的凋亡指数比正常对照组高,和Hirota等[2]报道的结果一致.凋亡的上皮细胞多分布于萎缩型的OLP,这可能是因为大量上皮细胞的凋亡导致了上皮层的萎缩、变薄,提示OLP上皮萎缩的改变可能和凋亡相关;同时观察到在凋亡的上皮细胞较密集的OLP病例,多出现较明显的基底细胞液化变性,故推测OLP基底层上皮细胞的液化变性和凋亡有关.而观察到OLP固有层淋巴细胞的凋亡指数比正常对照组有所降低则提示OLP固有层中淋巴细胞的凋亡受到抑制,细胞不能经历正常的凋亡过程而聚集在OLP的固有层中.

Caspase家族是细胞发生凋亡的关键酶类,Caspase3是最重要的效应型Caspase.本探究结果表明,OLP患者口腔黏膜上皮表达Caspase3明显增强(P%26lt;0.05),提示OLP中Caspase家族的级联反应是在OLP上皮层的生发层内被激活的,胞核阳性表达是由于在细胞成熟、衰老、死亡时,Caspase3从胞质易位到胞核.

Nakagawara等[3]在退化凋亡神经母细胞瘤中报道了相似情况,由此推测胞核中的Caspase3可能和细胞凋亡有关,但具体机制不清.实验结果分析还提示,Caspase3在OLP上皮层细胞凋亡中起重要功能;而固有层淋巴细胞的生命活动更为复杂,TNFαTNFRI通路可能不仅仅介导细胞凋亡.

肿瘤坏死因子(TNF)是由于其能引起肿瘤组织出血性坏死而得名,TNFα和TNFRI和相关分子结合,激活Caspase3而最终导致靶细胞凋亡[4].Erdem等[5]检测到OLP患者血清中的TNFα水平明显比正常对照组高,SimarkMattsson等[6]发现OLP的T细胞有TNFαmRNA的表达.本探究结果提示,OLP上皮细胞的凋亡异常可能是通过TNFαTNFRI介导的凋亡通路实现的,OLP固有层中的淋巴细胞表达TNFα,通过结合上皮细胞表面的TNFRI诱导上皮细胞凋亡;OLP固有层淋巴细胞的凋亡可能也是由TNFαTNFRI介导实现的,但是由于TNFRI表达的减少,导致TNFα没有足够的受体结合而不能正常发挥功能,抑制了细胞凋亡,这也说明靶细胞表面TNFRI的质和量直接影响TNFα的敏感性.沈丽佳等[7-8]的探究结果表明,OLP中的上皮细胞和固有层淋巴细胞都是TNFα潜在来源,当OLP中上皮细胞表达TNFα及固有层淋巴细胞表达TNFRI减少时,TNFαTNFRI介导淋巴细胞的凋亡途径受阻,淋巴细胞得以“逃逸”正常的凋亡而聚集于OLP的固有层中.本实验中,OLP固有层淋巴细胞TNFα的表达还和其自身的AI呈负相关,因为TNFα和受体结合后,介导的不止是凋亡通路,还有可能激活NFκB通路,从而产生有利于细胞生存的信号,导致细胞增殖.这也说明了TNFαTNFRI细胞信号传导通路的复杂性,其选择死亡或生存信号的机制有待进一步探索.

本探究中糜烂型OLP固有层淋巴细胞TNFα的表达明显高于非糜烂组,说明TNFα在OLP中除了诱导上皮细胞的凋亡外,还可能通过抑制细胞的生长或通过细胞毒功能,损伤上皮细胞,导致临床上出现上皮萎缩、糜烂等表现.TNFα表达的高低对于OLP临床诊断及治疗的指导意义还有待进一步探索.

口腔扁平苔藓责任编辑:刘老师    阅读:人次