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奥曲肽联合特异性CO.2抑制剂对肝癌细胞抑制作用
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作者:俞谦,孙为豪,刘顺英,欧希龙,曹大中,苏菡,江洁,俞婷

【关键词】肝癌

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheexpressionofsubstancePinrats'intestinaltissueandstudytherelationbe-tweensubstancePandmucosapermeabilityinacutenecrotizingpancreatitis(ANP).Methods80adultSprague-Dawleyratswererandomlydividedintocontrolgroup(n=40)andANPgroup(n=40).Sacrificesweremadein8,12,16and20hlaterineverygroupafterANPmodelwasestablishedbyinjecting5%sodiumtaurocholateintopancreaticductrespectively.Thein-testinalmucosalpermeabilityandtheexpressionofsubstancePwerestudied.ResultsInANPgroups,intestinalmucosalper-meabilityandtheexpressionofsubstancePweresignificantlyhigherthanthoseinthecontrolgroup(P<0.05).Theoverex-pressionofsubstancePwascorrelatedwiththeintestinalmucosalpermeabilityinANP(r=0.66,P<0.01).ConclusionTheexpressionofsubstancePandthepermeabilityinintestineofratsareincreasedsignificantlyinANP.Thereexistsapossi-tivecorrelationbetweensubstancePandtheintestinalpermeability.

Keywords:acutenecrotizingpancreatitis;neurokinin-1receptor;substanceP;intestinalmucosalpermeability;rats

[摘要]目的:研究特异性环氧化酶.2(COX.2)抑制剂NS.398和生长抑素类似物奥曲肽联合使用对人肝癌细胞系SMMC.7721增殖、凋亡的影响。方法:采用四氮唑盐比色法(MTT法)观察细胞增殖活力改变,流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。结果:(1)MTT法显示NS.398和奥曲肽均在一定范围内呈浓度和时间依赖性地抑制SMMC.7721细胞的增殖;联合用药组抑制率显著高于单用NS.398或奥曲肽组(P<0.01),金正均方法显示q>1.15,提示两药联合应用有协同抑制肝癌细胞增殖效应,并随着作用时间延长而增强。(2)流式细胞仪测定显示,NS.398、奥曲肽和两药联合作用于SMMC.7721细胞24h后,联合用药组细胞凋亡率显著高于单一用药组(P<0.01)。结论:NS.398和奥曲肽呈剂量、时间依赖性地抑制SMMC.7721细胞增殖,促进SMMC.7721细胞凋亡,两者联合应用具有协同作用。

[关键词]NS.398;奥曲肽;肝癌;细胞增殖;凋亡

对失去手术机会根治无望的原发性肝癌(primaryhepaticcarcinoma,PHC)目前尚缺乏有效的治疗手段。近年来国内外研究表明,非细胞毒性药物可抑制肿瘤的生长甚至转移,不良反应较轻。这类药物主要包括生长因子、激素、激素拮抗剂及环氧化酶.2(COX.2)抑制剂等[1~3]。鉴于肝癌的发生和发展的多因素性和多环节性[4],联合用药方案成为大多数学者的选择。由于生长抑素类似物奥曲肽和特异性COX.2抑制剂的抗肿瘤机制不同,因此本研究通过肝癌细胞体外培养,采用四氮唑盐(MTT)比色法(MTT法)、流式细胞仪检测等方法,来观察奥曲肽联合特异性COX.2抑制剂NS.398对肝癌细胞生长有无协同抑制作用,为联合应用NS.398和奥曲肽治疗肝癌提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系来源

SMMC.7721人肝癌细胞系为东南大学遗传中心实验室所赠。

1.1.2主要试剂

NS.398(美国Cayman公司),奥曲肽(瑞士诺华公司),RPMIMedium1640(美国Gibco公司),HEPES、小牛血清、胰蛋白酶、MTT(Amresco公司),AnnexinⅤ.FITC试剂盒(Gender公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

肝癌SMMC.7721细胞常规培养于含有10%小牛血清、100U・ml-1青霉素、100U・ml-1链霉素的RPMI1640培养液中,吹打细胞使之悬浮并接种到培养瓶中,37℃、CO2体积分数为0.0

5、饱和湿度条件下培养。每2~3d用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2MTT法

实验先设空白组[仅含培养液和等体积的二甲亚砜(DMSO)]、对照组(SMMC.7721细胞的单细胞悬液200μl加等体积的DMSO)及实验组(SMMC.7721细胞的单细胞悬液200μl加药物100μl)。实验组又分为NS.398、奥曲肽的不同浓度梯度组,其中NS.398为5个浓度梯度(1×10-8~1×10-4mol・L-1),奥曲肽也为5个浓度梯度(1×10-9~1×10-5mol・L-1),每组设4个复孔。取对数生长期的SMMC.7721细胞制成单细胞悬液,调整细胞浓度为5×104ml-1,接种于96孔培养板内(200μl・孔-1)培养24h,加入不同浓度的药物100μl,分别培养1

2、2

4、48及72h,然后每孔加入MTT液20μl(5mg・ml-1),继续培养4h,吸去上清液,每孔加入DMSO150μl终止反应,将96孔板移入平板震荡器,水平震荡10min,使MTT还原产物完全溶解,用DG.3022A型酶联免疫检测仪于570nm波长处测定每孔吸光度(A)值,结果以每组4个孔的ˉx±s表示,实验重复3次。由以上实验得出奥曲肽在1×10-6mol・L-1作用72h抑制率为42.4%,NS.398于1×10-5mol・L-1作用72h抑制率为44.6%,都接近半数抑制量,故以下实验选择1×10-6mol・L-1奥曲肽联合1×10-5mol・L

-1NS.398作用于SMMC.7721细胞72h,初步观察两药的相互作用。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡情况

收集NS.398、奥曲肽单用及联合应用24h后的SMMC.7721细胞1.0×106ml-1,PBS洗涤后用消化液消化成单细胞悬液,取1ml细胞,1000r・min-

1、4℃离心10min,弃上清,加入1ml冷的PBS,轻轻震荡使细胞悬浮,1000r・min-

1、4℃离心10min,弃上清,重复用冷的PBS洗两次,将细胞重悬于200μlBindingBuffer,加入10μlAn-nexinV.FITC和5μl碘化丙啶轻轻混匀,避光室温反应15min或4℃反应30min,加入300μlBindingBuffer,在1h内上机检测细胞的凋亡率。

1.3药物相互作用结果判断

用金正均方法[5],在量效曲线线性区内,两药合并用药的抑制率及两个单用药的抑制率用如下公式计算q值:q=两药合用的抑制率.两单药预计抑制率=EA+B.EA+(1-EA)×EB。当q=1.00±0.15时,两药有相加作用;q>1.15时,两药有协同作用;当q<0.85时,两药有拮抗作用。

1.4统计学处理

MTT法和流式细胞仪测定数据采用统计软件SPSS11.5统计处理,显著性检验采用单因素方差分析,P<0.05表示差异有显著性。

2结果

2.1MTT法比色结果

NS.398、奥曲肽不同浓度、不同时间对细胞的抑制率按下列公式计算:肿瘤细胞的生长抑制率(%)=(1-实验组A值.对照组A值)×100%,结果见表

1、

2、3。表1奥曲肽作用于SMMC.7721细胞的吸光度与抑制率时间.hA值(略)表2NS.398作用于SMMC.7721细胞的吸光度与抑制率时间.hA值(略)表3奥曲肽联合NS.398作用于SMMC.7721细胞的吸光度与抑制率时间.hA值(略)

结果表明,1×10-6mol・L-1奥曲肽联合1×10-5mol・L-1NS.398作用于SMMC.7721细胞2

4、48、72h后,吸光度与对照组相比有显著性差异(P<0.01),与两药单用相比也有显著性差异(P<0.01);联合用药组的抑制率与两药单用相比有显著性差异(P<0.01),药物相互作用q24h=1.20,q48h=1.24,q72h=1.28,初步提示两药联用对细胞增殖有协同抑制作用,且协同作用随时间的延长而增强。

2.2细胞凋亡情况检测结果见表4。表4奥曲肽、NS.398单独及联合作用24hSMMC.7721细胞的凋亡率(略)

结果表明,1×10-6mol・L-1奥曲肽、1×10-5mol・L-1NS.398单独及联合作用于SMMC.7721细胞24h后,细胞凋亡率与对照组相比有显著性差异(P<0.01),联合用药组与各单独用药组相比也有显著性差异(P<0.01),提示两药联合应用能显著提高肝癌细胞的凋亡率。

3讨论

本研究结果显示:(1)特异性COX.2抑制剂NS.398、生长抑素类似物奥曲肽可以抑制肝癌SMMC.7721细胞的生长,在一定范围内呈浓度和时间依赖性;联合应用NS.398、奥曲肽对SMMC.7721细胞的增殖呈协同抑制作用,并随时间的延长抑制作用也增强。(2)NS.398、奥曲肽可以诱导SMMC.7721细胞的凋亡,两者联合应用可显著提高肝癌细胞的凋亡率。

最近的研究表明,生长抑素类似物奥曲肽与其特异性受体(SSTR)结合后经过4个重要信息传导途径发挥直接的抗肿瘤作用:(1)环磷酸腺苷(cAMP)途径。一般认为胞内cAMP升高会诱发肿瘤增殖活动,而奥曲肽结合后的SSTR能与腺苷环化酶负性结合,降低胞内cAMP浓度,从而抑制肿瘤增殖。(2)有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)途径。奥曲肽可通过SSTR的介导激活酪氨酸磷酸化酶(PTP),从而调控MAPK活性,影响癌基因c-fos、c-myc、c-jun的转录,抑制DNA蛋白质的合成,使肿瘤细胞进入静止期而停止增殖。(3)钙离子(Ca2+)途径。奥曲肽结合后的SSTR

2、SSTR5可通过抑制细胞外Ca2+内流降低细胞内Ca

2+浓度,从而发挥抗肿瘤细胞增殖作用。(4)磷酸酪氨酸磷酸酶(pt-pase)的激活。膜蛋白上酪氨酸残基的磷酸化与信息传导通路有关。酪氨酸激酶的活化刺激细胞生长及过度表达、持续激活,导致细胞转化,而ptpase则能抑制这种作用。因此认为奥曲肽通过SSTR激活ptpase,干扰细胞周期,发挥抗有丝分裂作用。

奥曲肽还可通过减少某些生长因子、激素的分泌和肿瘤的血供,调节机体免疫活性和促进细胞凋亡等方式而发挥间接抗肿瘤作用。

大量研究表明,COX.2的过度表达与消化道肿瘤的发生、发展密切相关。COX.2促进肿瘤发生发展的作用主要通过其催化产生的前列腺素E2(PGE2)而发挥。PGE2是一种免疫调节抑制因子,高浓度的PGE2可抑制抗肿瘤抗体的产生及巨噬细胞、T杀伤细胞的活性,抑制TNF.α、IFN.α等淋巴因子的产生而有利于肿瘤的生成。PGE2还可刺激成纤维细胞的有丝分裂而诱导肿瘤血管形成,并诱导bcl.

2、H-ras、K-ras等促癌基因的表达而抑制凋亡、促进增殖[6]。动物实验已经证实,COX-2基因表达及其产物PGE2能够促进凋亡抑制基因bcl-2的表达并引起细胞凋亡减少[7,8]。过度表达COX.2已证实能导致转基因鼠发生肿瘤。而一般认为COX.2抑制剂主要通过抑制COX.

2、减少PGE2的生成和抑制MAPK的活性,使肿瘤增殖受到抑制。而有研究显示,选择性COX.2抑制剂抑制肝癌细胞的作用随着COX.2抑制剂选择性的增高而增强[9]。

由此可见,生长抑素、COX.2抑制剂均能通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡而在肝癌的治疗中起重要作用。奥曲肽和NS.398抑制肿瘤生长的机制不尽相同,但在哪些环节上产生协同作用尚不清楚。有研究表明,奥曲肽能抑制转录激活蛋白.1(activatorprotein.1,AP.1)的活化[10],而COX.2启动子上有AP.1结合位点[11],当两者联合应用时,可能加强抑制AP.1DNA结合活性,使肿瘤基因、COX.2及其他生长因子的转录下调至很低水平甚至停止,从而产生显著的抑制肿瘤生长、促进肿瘤坏死的作用。Hussin等

[12]的研究均发现非甾体抗炎药也能抑制MAPK活性,MAPK信号途径可能是两者协同作用的重要途径之一。

本研究以人肝癌细胞株SMMC.7721作为研究对象,利用MTT法探索奥曲肽、NS.398对SMMC.7721细胞的增殖抑制作用,MTT法测定原理是活细胞线粒体内脱氢酶可将MTT裂解为蓝紫色的甲月赞结晶,甲月赞产量与活细胞数成正比。该方法误差小,目前广泛用于活细胞检测及药物敏感性检测。结果证实:NS.398、生长抑素对肝癌SMMC.7721细胞的增殖均有明显抑制作用,其抑制作用在一定范围内呈浓度、时间依赖性增高。一定浓度下两药联合应用对肝癌细胞的增殖呈协同抑制作用,并随作用时间的延长而增强。

流式细胞仪测定细胞凋亡的物质基础为核酸内切酶激活、DNA广泛断裂。由于细胞通透性增加和固定剂的影响,降解的DNA碎片在洗染过程中从细胞内逸出,因此凋亡细胞的DNA含量减少;凋亡的细胞由于发生DNA降解,与荧光染料的结合减少,故细胞的荧光强度降低。本实验结果显示,1×10-5mol・L-1NS.398、1×10-6mol・L-1奥曲肽单独及联合作用于SMMC.7721细胞后,3组的细胞凋亡率分别为(14.85±0.60)%、(6.12±0.68)%及(19.83±1.90)%,与正常对照组比较均显著增高,且联合用药组细胞凋亡率显著高于单独用药组,说明NS.398联合奥曲肽较两者单独应用更能促进肝癌细胞的凋亡。两药联用时,奥曲肽还可作用于胃黏膜壁细胞上的生长抑素受体,降低胃酸分泌,可进一步减少COX.2抑制剂的胃肠道副作用。奥曲肽联合NS.398对肝癌细胞生长的高效抑制作用及低副作用,使其有望成为PHC的一个治疗方法。

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奥曲肽联合特异性CO.2抑制剂对肝癌细胞抑制作用责任编辑:飞雪    阅读:人次