电针老鼠耳穴升压神经活动的影响范文

本文作者：刘坤李亮贲卉赵玉雪荣培晶高昕妍朱兵单位：中国中医科学院针灸研究所

临床观察显示针刺对原发性高血压患者有良好的治疗效果［1］。临床及实验研究结果表明，针刺降压有一定的穴位特异性，其中针刺“耳甲”“足三里”“曲池”“丰隆”等穴有较好的降压作用［2－4］，而“内关”“公孙”“百会”等穴有一定的升压作用［5－7］。针刺对血压的调节，是由脊髓及脊髓上中枢协同完成的。针刺引起的体表－内脏反射有脊髓固有反射及脊髓上反射两种形式，也是针刺调节心血管功能的重要神经反射形式［8］。其中对脊髓节段性反射的研究较多，得出了公认的结论［9］。孤束核（nucleusofthesolitarytract，NTS）位于延髓背侧，参与心血管、呼吸、胃肠等多种内脏功能的调控，也是心血管压力感受性反射的第一级感觉中继站［10－12］。在血压的调节过程中，NTS与迷走神经背核、延髓头端腹外侧核（rostralventrolateralmedulla，rVLM）、延髓尾端腹外侧核（caudalventrolateralmedulla，cVLM）、疑核等中枢核团有纤维联系，通过交感和副交感神经传出通路完成对血压的调节［13］。还有研究表明，不同躯体部位及耳针刺激信息的传入，通过间接和直接的途径到达NTS进行汇聚［14－16］。我们认为针刺信号可以通过影响NTS中特定的与血压调节有关的神经元，以体表－心血管反射的形式完成对血压的调控。但对于NTS中与血压调节有关神经元的鉴别及机体不同血压状态下针刺效应的同步研究，目前尚不多见。本实验拟观察不同穴位电针对麻醉大鼠血压的影响，同步记录NTS细胞外电活动，探讨针刺在不同血压状态下的降压作用，阐明NTS升压反射相关神经元在针刺降压过程中的变化特点，以深入探讨针刺降压的中枢机制。

1材料与方法

1．1动物健康成年Sprague－Dawley雄性大鼠（250～350g）47只，中国医学科学院实验动物中心提供，清洁级，实验动物许可证号：SCXK（京）2009－0017，饲养于12h光照／12h黑暗的环境中，自由饮水和摄食。实验过程中对动物的处置遵照科技部的《关于善待实验动物的指导性意见》规定。

1．2主要试剂与仪器脱羟肾上腺素（Phenylephrine，PE，Sigma）；立体定位仪（SR－6R，日本光电），推进器（DMA－1510，美国），微电极放大器（Model1800，美国），Micro1401mR生理信号采集分析系统（CED，英国），BIOPAC（MP150多道生物信号采集分析系统，美国），微量注射泵（ALC－IP800，上海奥尔科特生物科技有限公司），刺激器（SEN－7203，日本光电），隔离器（SS102J，日本光电），动物恒温系统（ALC－HIP，上海奥尔科特生物科技有限公司），玻璃微电极拉制仪（ModelP－97，美国），针灸针（0．25mm×30mm，苏州医疗用品厂），冰冻切片机（Thermo，MicromInternationalGmbH，德国）。

1．3实验动物制备大鼠用10％乌拉坦（1．0～1．2g／kg）腹腔注射麻醉。手术及实验过程中动物体温用恒温仪维持在37℃左右。动物行颈静脉、颈动脉、气管插管术后，动脉插管通过三通与注射器和压力传感器相连，实时记录及监测平均动脉压（meanarterialpressure，MAP）的变化，注射器内留置2mL200U／mL的肝素，以防血管堵塞。静脉插管直接与注射器相连，以备静脉用药。动物俯卧，将大鼠头部用耳棒固定于立体定位仪上，暴露小脑后端及延髓。在显微镜下剥离软脑膜，暴露的脑组织用温的石蜡油覆盖。以立体定位仪确定NTS坐标位置：闩部上下1．0mm，中线旁开0～1．0mm，深度0．3～0．8mm。在手术显微镜下插入玻璃微电极至延髓表面，随即以石蜡油覆盖以防止干燥及减少延髓波动对微电极位置的影响。玻璃微电极在P－97微电极拉制仪上拉制，尖端直径1μm左右，测定微电极直流电阻应为10～15MΩ，记录前灌冲2．0％醋酸滂胺天蓝电极液。

1．4实验记录同步记录NTS神经元放电及MAP，在微电极推进器下，以2μm／s的速度推进玻璃微电极，在0．3～0．8mm深度之间寻找放电稳定的神经元；在此基础上经静脉注入PE（4μg／kg），以鉴定该神经元对MAP上升的反应。MAP升高超过10mmHg（1mmHg≈0．133kPa）、NTS神经元放电频率增加或减少15％即界定为血压相关神经元。待NTS神经元自发放电稳定、MAP恢复至正常后，记录30s放电脉冲数作为对照值，然后电针耳穴“心”及体穴“内关”“足三里”各30s，各穴电针时间间隔至少在5min以上。为排除针刺穴位顺序对神经元放电结果的影响，穴位随机排序，观察电针对MAP及NTS神经元放电的影响。以0．2mL／min（2μg／mL）的速度在大鼠颈静脉微量注射PE（6～12μg／kg，维持15～30min）造成药物性血压升高超过15mmHg及以上。在升压平台期再分别电针上述穴位，并观察其对MAP和NTS神经元放电的影响。神经元放电的信号经微电极放大器放大，MAP信号经BIOPAC转化为电信号后输入Micro1401mR生理信号采集分析系统，SPIKE2软件进行数据处理。神经元放电记录结束后，用刺激器通过隔离器经微电极放大器向玻璃微电极通以20μA的阴极直流电20min，将玻璃微电极内2％的醋酸滂胺天蓝电极液导入脑组织以标记记录位置。灌流切片后确认正确的记录位点，位置不符合者数据不纳入统计。

1．5穴位定位及电针刺激按照《实验针灸学》［17］选穴。左“足三里”穴在左腓骨小头下约5mm处；左“内关”穴在左前肢1／6折点处外侧，桡、尺骨缝中；左耳穴“心”在耳甲腔中央。电针强度2mA，频率10Hz，波宽500ms，参考电极放在穴位旁开0．5mm处。

1．6统计学处理血压数据用均值±标准误（x珚±sx珔）表示，针刺前后比较用配对t检验，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间进一步的两两比较采用LSD检验，均以P＜0．05作为差异有统计学意义的标准。据本研究组以往对NTS神经元自发放电的研究，以刺激前后放电频率超过15％作为标准，神经元对针刺的反应分为兴奋、抑制和无反应，刺激后频率变化增加15％判断为升压反射相关神经元。神经元对刺激反应的分类个数属计数资料，神经元放电变化表示为增加百分比，组间变化率的比较采用LSD分析。以上数据输入SPSS13．0统计软件进行统计分析。

2结果

2．1NTS与升压反射有关的神经元的鉴别麻醉大鼠颈静脉注射PE后，在记录动脉血压升压反射的同时，分辨并完整地记录到67个NTS神经元细胞外放电，其中15个细胞（22．39％）放电频率增加，呈兴奋反应，放电频率的净增加率为（63．59±13．21）％；36个神经元（53．73％）放电频率无变化；16个神经元（23．88％）放电频率减少，呈抑制反应，放电频率的净降低率为（49．28±11．50）％。

2．2电针作用于耳穴“心”及体穴“内关”“足三里”对大鼠生理状态下MAP及NTS神经元放电的影响如图1所显示的单个例子，电针耳穴“心”和体穴“足三里”能够明显降低实验动物的MAP，与此同时，NTS与升压反射相关神经元的放电明显增加；电针“内关”虽然也能轻度激活NTS神经元放电，但对MAP没有明显影响。正常大鼠的MAP范围为82～120mmHg。统计结果表明（图2），生理血压状态下，电针耳穴“心”使动物的MAP由原来的（100．11±3．30）mmHg下降为（88．47±3．75）mmHg，下降了（11．64±0．45）mmHg（P＜0．001）；电针“足三里”使MAP下降了（5．74±0．64）mmHg（P＜0．001）；电针“内关”对MAP无显著影响（P＞0．05）。不同穴位组间降压效应比较显示，电针耳穴“心”和体穴“足三里”对MAP的影响大于“内关”（P＜0．05）。针刺不同穴位引起MAP变化的同时，对生理MAP状态下NTS与升压反射相关神经元的放电频率的影响以兴奋性为主。对升压反射有兴奋性反应的15个神经元待MAP恢复至生理状态时，电针大鼠耳穴“心”，8个放电频率增加［净增加率为（115．20±15．25）％］，7个放电频率无变化或减少；电针“内关”穴，7个神经元放电频率增加［净增加率为（54．24±6．89）％］，8个放电频率无变化或减少；电针“足三里”穴，7个神经元放电频率增加［净增加率为（103．35±14．78）％］，8个放电频率无变化或减少。组间比较结果显示，电针耳穴“心”和“足三里”两个穴位对神经元激活增加的百分比较“内关”穴显著增高（P＜0．05）。见图3。

2．3电针作用于耳穴“心”及体穴“内关”“足三里”对PE引起MAP升高状态大鼠MAP和NTS神经元放电的影响在大鼠颈静脉注射PE造成药物性升压模型，MAP由生理的（99．28±3．82）mmHg，上升并维持在（121．66±2．91）mmHg。如图4所显示的单个例子，电针耳穴“心”和体穴“足三里”能够明显降低实验动物升压平台期的MAP，与此同时，NTS与升压反射相关神经元的放电明显增加；电针“内关”虽然也能轻度激活NTS神经元放电，但对MAP没有明显影响。统计结果表明（图5），在PE引起的升压平台期，电针耳穴“心”使动物的MAP由原来的（124．17±4．43）mmHg下降到（118．70±3．64）mmHg，下降了（8．30±0．79）mmHg（P＜0．001）；电针“足三里”使MAP下降了（6．07±0．79）mmHg（P＜0．05）；电针“内关”对MAP无明显影响（P＞0．05）。组间比较显示，电针耳穴“心”和体穴“足三里”的降压效应好于“内关”（P＜0．05）。比较同一穴位电针对麻醉大鼠生理状态和PE引起血压升高状态下MAP的影响，结果表明两种状态下MAP的差异无统计学意义（P＞0．05）。电针不同穴位引起升压平台期MAP变化的同时，对NTS与升压反射相关神经元的放电频率的影响以兴奋性为主。对升压反射有兴奋性反应的15个神经元中，电针耳穴“心”，9个放电频率增加［净增加率为（92．94±10．42）％］，6个放电频率无变化或减少；电针“内关”穴，9个神经元放电频率增加［净增加率为（44．66±6．27）％］，6个放电频率无变化或减少；电针“足三里”穴，8个神经元放电频率增加［净增加率为（86．73±5．57）％］，7个放电频率无变化或减少。组间比较结果显示，电针耳穴“心”和“足三里”两个穴位对神经元激活增加的百分比较“内关”穴显著增高（P＜0．05）。见图6。

3讨论

颈动脉窦和主动脉弓压力感受器反射是交感神经和副交感神经通过上位中枢调节MAP的重要途径［18］。这种负反馈调节形式在一定血压范围内比较敏感（100mmHg左右），且调定点随动脉血压状态可以重新调定。如高血压时调定点上移，压力反射调节可以在血压较高水平上工作［19］。交感神经活动过度兴奋和动脉血压调定点上移是高血压病的主要病理机制［20］。与血压调节有关的中枢主要包括下丘脑弓状核、rVLM、cVLM、中脑导水管周围灰质腹外侧区、苍白球、脊髓背角和中间外侧部［21］。NTS是内脏感觉传入到上位中枢的第一级中继站，和rVLM之间有着双向的纤维投射［22］，电生理学实验也证明NTS存在对血压反射敏感的神经元［23］。压力感受器传入首先投射到NTS神经元，由此直接或间接与血压感受反射的迷走传出（疑核）和交感传出（通过rVLM和cVLM的神经元）中枢联系，调节心血管功能状态，从而调节血压［24］。Zhang等［25］对麻醉大鼠的研究表明，NTS内存在对升压反射敏感的神经元，但不对血压的绝对升高有持续反应，动脉血压高水平范围内的自稳调节是多种传入编码的结果，而不是由单个神经元阶梯状放电的变化介导的。NTS接受主动脉减压神经（ADN）传入的神经元大多数对血压的增加产生兴奋性的反应，我们的研究可能既包含了ADN传入的NTS神经元，也包含了有自发放电但与ADN激活无关的NTS神经元，NTS神经元对PE引起的升压反射既有兴奋性反应也有抑制性反应，但以兴奋性反应为主。本研究组及其他研究组前期工作表明，麻醉大鼠在生理血压状态下，刺激与心交感神经支配同节段的“内关”穴，主要引起交感神经兴奋效应，通常不产生降压作用，而刺激与心异神经节段的“足三里”穴能抑制交感神经功能引起降压效应［26］。也有人认为，电针“足三里”能抑制NTS内侧亚核P物质的释放并且能够激活c－fos基因在中枢延髓和背核中的表达，即电针“足三里”穴可以增强迷走中枢的兴奋性［27］。耳穴由于有迷走神经耳支的支配，也引起稳定的降压效应。如高昕妍等［2，28］的研究表明，针刺“耳甲”激活副交感神经电活动能降低大鼠血压，此降压效应与迷走神经中枢功能与结构的完整密切相关，特别是与NTS中心功能相关神经元的激活有关。自发性高血压大鼠的实验研究表明，针刺耳穴“心”能引起比正常大鼠更显著的降压作用［2］。而本研究药物引起的血压升高平台期（平均120mmHg）与自发性高血压大鼠的基础平均血压（180mmHg）有明显不同。另外，PE作为肾上腺素能α受体激动剂，使周围与交感神经α受体有关的功能均上调，如：使除冠状动脉以外的小动脉强烈收缩，引起外周阻力明显增大而引起血压升高等［29］。因而本实验中针刺对血压升高大鼠的降压幅度与正常大鼠差异不明显。根据本实验结果，结合以往研究，我们认为针刺耳穴“心”和体穴“足三里”在生理状态和药物引起血压升高状态下都有一定降压作用，这种降压效果与NTS中升压反射敏感神经元的同步放电有关，这些升压反射相关神经元对针刺的反应以激活为主，并且存在一定的穴位特异性。