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表观继承毒物学安全指数评估
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作者:殷宏 金涌 邢仕歌 田世民 单位:中国检科院综合检测中心毒理实验室 北京

自从1957年Waddington提出表观遗传学的概念后,表观遗传学和表观基因组学有了相当大的发展。表观基因组学是在全基因组水平上研究表观遗传学标志及其与基因表达的相互关系。这一新兴领域已对毒理学研究与实践产生重大的影响。国内,表观遗传学在毒理学研究已较深入地开展了一些研究,并发表了综述。

1外源化学物的表观遗传毒性

基因表达的表观遗传调控是通过DNA甲基化,组蛋白编码和相关的非编码RNA(如miRNA)来完成的。3种机制各自的贡献取决于特定基因及其环境,如物种,细胞类型,机体的发育阶段和年龄,此外,每个因素可能受到其他因素的影响。因此,表观基因组的调控是一个强大的和动态的综合过程,在发育和维持分化状态中起关键作用。虽然表观基因组不是所有的改变预期都是有害的,但有些可能产生有害结果(如发育异常,增加疾病易感性等)。在体外,动物和人类的研究已经确定了几类环境化学物,可以修饰表观遗传标志,包括金属、过氧化物酶体增殖剂、空气污染物、毒物和内分泌干扰物/生殖毒物。目前环境化学物表观遗传标志的研究大多数集中在DNA甲基化,只有少数研究涉及组蛋白修饰和miRNA(表1~3)。外源化学物引起表观遗传学改变可影响细胞应激,并是潜在可逆的;也可能是可遗传的。表观遗传毒性(epigenotoxicity)是指脱离外源化学物暴露后,可遗传的有害改变。广义的表观遗传毒性也可以包括外源化学物引起非遗传的表观遗传学改变中介的外源化学物毒效应。可遗传的表观遗传毒性和表观遗传改变中介的毒效应是有区别的。表观遗传毒性可以被分为有丝分裂的,减数分裂的或跨代遗传的3类。表观遗传毒性这一新兴研究领域对毒理学产生了重大的影响。下文主要讨论目前表观遗传毒性测试的主要发现及国际生命科学研究所(ILSI)“评估表观遗传变化”的研讨会的意见。

2表观遗传毒性的主要发现

2.1化学致癌近年来在多种肿瘤细胞观察到表观遗传事件。表观遗传事件可能引起基因表达的变化通过DNA甲基化,组蛋白修饰和/或染色质重构。并估计,在肿瘤细胞中检测到甲基化变化的数目远远多于遗传改变的数目。研究发现表观遗传事件参与环境与职业因子诱发癌变进程的引发和进展。DNA甲基化异常对肿瘤发生有因果关系作用,甲基胞嘧啶增加突变可能性,增加致癌物结合,肿瘤抑制基因沉默,DNA修复基因沉默,癌的DNA低甲基化和遗传学改变。组蛋白修饰可能通过影响DNA修复和细胞周期关卡,引起遗传学改变。传统的致癌性试验可确定表观遗传修饰诱导肿瘤的可能性。许多不同的啮齿类致肝癌物已被确定,而研究发现这些化合物的作用模式并无遗传毒性,与人类也无关联性。例如过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-A)介导的和构成性雄甾烷受体(CAR)介导的啮齿类动物癌变。肝肿瘤促长剂苯巴比妥(PB),其与CAR的激活和随后的效果相关。PB诱导的啮齿类表观遗传学改变包括甲基化改变的区域,基因表达的特殊改变和外源性及内源性化合物的代谢。持续的核受体介导的肝脏致癌物的分子分析,将更加明确地表征每个受试化合物的作用模式。表观基因组正常变异性的表征和与处理相关的表观遗传学影响的理解,将是研究致癌作用模式的巨大挑战。

2.2遗传毒理学评价化学物引起遗传损伤的能力是风险评定的重要内容。表观遗传学影响基因表达的可遗传的变化可能构成遗传毒性。表观遗传导致基因改变的机制包括:错配修复基因表观遗传缺陷,增加DNA修复基因表观遗传缺陷与癌症特定突变谱相关,参与双链断裂修复的基因的表观遗传失活,有丝分裂关卡基因表观遗传缺陷,致癌物解毒基因与甲基胞嘧啶突变可能性增加,DNA全面低甲基化和染色体不稳定等。已经确定表观遗传学改变在肿瘤形成中具有一定的作用。在肿瘤发展过程中DNA甲基化模式的改变往往是最早观察到的分子事件。甲基胞嘧啶(5meC)已知是C∶G至T∶A转换突变的热点,起因于胞嘧啶自发性水解和酶脱氨基率的增加和DNA修复降低。增加的5meC脱氨基率和T碱基修复受限可解释在CpG位点突变频率的增加。人类肿瘤p53基因突变的1/4和肿瘤抑制基因p16的C-T转换的1/3已知会发生在CpG位点上。突变的增加也可能来自于饮食中甲基供体的不足。已证明叶酸补充剂能减少溃疡性结肠炎患者发生结肠癌的风险和和预防结肠癌细胞p53突变。参与叶酸代谢的酶遗传多态性影响表观遗传标志,改变SAM水平,并能调节结肠癌的风险。也已提出DNA氧化性损伤在癌症的发生、心血管疾病和衰老中所起的作用。8-羟基鸟嘌呤(8oxoG)改变了CpG二核苷酸相邻的C的甲基转移酶活性,可能改变DNA甲基化。在CpG内C5-位的损伤影响DNA甲基化。在体外,5meC和5-氯C因启动子甲基化引起次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Hgprt)基因的沉默。此外,CpG内的8oxoG和HmC或显著减少结合于DNA的MeCP2,并直接导致染色质结构改变。光二聚物,烷基化碱基,脱碱基位点,以及链断裂也会诱导DNA的甲基化变化。对性细胞的致突变性将于下文讨论。体外哺乳动物细胞基因突变试验能够筛选表观遗传学介导的危害。例如,在不同啮齿类细胞系经5-氮胞苷处理TK基因可恢复活性。此外,DNA合成抑制剂3-叠氮基-3-脱氧胸苷(AZT)可引起TK位点超甲基化。应进一步开发筛选试验以确定表观遗传学中介的遗传毒性。

2.3发育与生殖的表观遗传毒理学完全分化的体细胞,在正常情况下,将有相对稳定的表观基因组传递到子代细胞。但在哺乳动物的发育过程中,早期胚胎发育过程(着床前),以及在子宫内原始生殖细胞的发育过程中,有两个表观遗传学的重编程阶段,重新设置DNA的甲基化模式。这两个发育的表观遗传重编程事件有可能是破坏表观遗传编程的敏感窗口。发育和生殖毒理学家特别感兴趣的是毒物暴露是否可以直接改变发育的表观基因组,有害的表型是否可跨代遗传,及因此存在的潜在危害。表观遗传编程紊乱可能有助于对表型的跨代遗传。使用Avy小鼠(黄色刺小鼠)模型,饮食暴露双酚A,使Avy和CabpIAP亚稳外延等位基因低甲基化。甲基供体膳食补充剂或染料木素可抵消此低甲基化效应。这些结果与造成表观遗传影响的其他内分泌干扰物报告一致。在环境相关水平低浓度的双酚A(1.2和2.4μg/kg体重)对大鼠可诱导跨代遗传表型异常。暴露于双酚A围生期雄性后代的精子计数和精子活力降低,并在F3代持续这些表型。甲氧滴滴涕和乙烯菌核利在子宫中暴露也会导致跨代生殖遗传表型异常。虽然甲氧氯和乙烯菌核利在高于人类接触的剂量观察到病理学改变,但此研究提供了一个模型来研究表观遗传跨代的机制。已证明,乙烯菌核利暴露后破坏了多达3代的小鼠精子一些印迹基因甲基化模式,这表明跨代遗传异常的表型也有表观遗传的基础。

2.4免疫毒理学已发现,表观遗传调控多能幼稚辅助性T细胞(Th)分化的启动和其效应亚群的成熟。启动后不久,幼稚T细胞同时转录低水平的Th1(CD4)和Th2(CD8)细胞因子,包括IL-2。在选择性转录成为Ifng(Th1细胞因子标记)或Th2细胞因子基因(IL-4和IL-5,IL-13)之前需要几次复制。在体外用5-aza诱导T细胞,导致由早先不产生这些细胞因子的T细胞系产生IL-2和IFN-g。在用组蛋白去乙酰酶抑制剂处理的CD4T细胞研究证实干扰素IFN-G和Th2型细胞因子的表达增强。上述研究结果表明,表观遗传机制是Th细胞分化和功能的关键因素。尽管与小鼠相比,人类IFNG基因缺乏脱甲基化,分化的人类Th细胞CpG甲基化分析显示出与小鼠类似的结果。将化学物诱导的小鼠T细胞分化的表观遗传学改变数据外推到人应要谨慎。

2.5其他终点从鼠类模型或单一基因的表观遗传学的某些成果已被外推于人类疾病原因。表观遗传学基础的表型被认为是人类疾病的起源有待进一步的研究,特别是确定表观遗传的正常变异和评价表观遗传影响需要适当的实验设计和对照。已经提出,内分泌干扰物的表观遗传毒性可能导致暴露人群的许多发育,代谢和行为障碍。对其他靶器官或终点的表观遗传毒性还有待研究。

2.6检测流程和模型Szyf2007年对检测表观遗传毒性提出的研究思路为:①在生命一个时间点的环境暴露可能会改变表观遗传编程,导致稳定改变表型和反应性,②毒物暴露可能导致表观遗传重编程,导致生命后期表型的变异。Reamon-Buettner和Borlak提出使用动物模型(如鼠类)环境暴露后分析表观遗传机制的研究方案,见图1。已推荐了检测表观遗传毒性的动物模型,特别是Avy小鼠和Axin1融合(Axin1Fu)小鼠能用于研究表观遗传学和发育畸形之间的联系,因为在特定的DNA甲基化模式的改变可以与小鼠遗传疾病广泛链接。

3ILSI的“评估表观遗传变化”研讨会

2009年10月ILSI的健康与环境科学研究所(IL-SI/HESI)主办“评估表观遗传变化”研讨会,评估和提高表观遗传学方面的科学知识基础及其在疾病中的作用,包括跨代的表观遗传变化的影响,还讨论了将表观遗传纳入安全性评价的几个问题。

3.1可能用于评价化学物产生表观遗传毒性的模型系统大鼠和/或兔可能是评价外源化学物产生表观遗传变化影响F1和/或F2和F3代的适当的模型。小鼠可能是更易于处理的模型,因为小鼠基因组有更多的数据,并已有用于检测表观遗传变化的工具。已建议Avy小鼠模型作为潜在的筛查工具,其毛色受亚稳Avy等位基因IAP隐蔽启动子附近CpGs甲基化状态的影响。然而,Avy小鼠模型用于筛选可能过于敏感。其他可能的模型包括斑马鱼和秀丽隐杆线虫,以及蜜蜂和果蝇。体外模型是使用哺乳动物细胞或利用干细胞。干细胞包括其他物种不存在的印迹基因。印迹基因有可能作为确定表观遗传改变的感应器。以上讨论的模型有可能用于潜在危害识别,并提供机制基础。然而,将很难直接解释这些数据对整体动物和人类的意义。在表观遗传模型转化为管理决策测试之前,需要进行大量的基础工作和验证研究。

3.2可能评价的终点/靶对于表观遗传变化的指标,应确定适应反应还是有害反应。确定表观遗传修饰与可能提示特定有害影响的疾病相关基因表达改变之间的因果关系或强的关联需要表型锚定。在发现受影响的表观遗传效应的基因与某种疾病相关的基础上,应建立由表观遗传机制调控的基因数据库。表观遗传效应很可能有物种,组织,暴露和时间特异性。目前,在研究中实验对照组是化合物反应表观遗传变化的最适当的参照,建立表观遗传印迹的参考对照范围可能是有意义的,因为这些区域甲基化模式可能更趋于稳定和遗传。

3.3可能应用的技术关于DNA甲基化和miRNA,以阵列为基础的平台,针对人类和小鼠样品已优化。针对大鼠可用的工具有限,但可用根据大鼠基因组序列基于阵列的高通量方法。虽然硫酸氢盐为基础的测序评价DNA甲基化方法可用于所有物种,但需要发展高通量测序方法。区分异常信号和背景信号并不容易,最大的挑战将是数据分析和解释,应发展信息学。

3.4管理机构的观点为了将表观遗传毒性纳入风险评定,有很多的考虑。必须明确的问题,理解环境、营养和/或药物暴露对个人,群体及跨代水平的公共健康的潜在长期影响,界定希望解决的问题,确定模型系统。这就需要努力使与有害结局和基线改变相联系的研究设计、方法和模型标准化。以适当的参考化合物、途径和剂量验证该模型。模型试验检测的任何变化必须以合理的方式链接到表型或临床结局。对于法规测试,方法必须标准化,具有重复性和重现性。为了将表观遗传数据有效地纳入人类风险评定,最好与管理机构共同努力,确定一个正常基线范围,并与有害结局关联,界定公共卫生关注的适当水平。管理机构将需要开发分析工具,以对公共健康方面的数据进行解释,并将此类数据应用于风险评定模式和慢性健康结局。

4小结

关注外源化学物引起表观遗传学变化可能产生的有害健康影响具有重要的意义。本文初步提出表观遗传毒性和由表观遗传学改变中介的毒性的概念,主要介绍了外源化学物的表观遗传毒性的研究现况和与纳入安全性评价的ILSI的讨论。为更好地理解表观遗传学领域及其与安全评估的关系,应重视识别表观遗传毒性的毒理学研究的终点、发展实验模型和对结果的解释,并将此类数据应用于风险评定模式。这些努力有可能形成新兴的科学领域———表观遗传毒理学(epigenotoxicology)。

表观继承毒物学安全指数评估责任编辑:陈老师    阅读:人次
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