镉汞综合对雌激素的重要性范文

作者：王思华陈小玉单位：河南省职业病防治研究院劳动卫生科郑州大学公共卫生学院毒理学教研室

环境雌激素是较为重要的一类内分泌干扰物，环境雌激素样物质既具有其自身的化学特性，还具有雌激素样作用，无论这些物质雌激素样作用的强弱，都能增加额外的雌激素负荷［1］。当亲代暴露于环境雌激素样物质，不仅对机体自身内分泌、神经、生殖和免疫等多系统造成损害，而且能够对子代造成不可逆的损害［2－6］，最近几年引起广泛关注。汞和镉广泛存在于生产和生活环境中，它们对人类和动物的损害作用是否也是通过内分泌干扰作用，而且两者联合是否有雌激素样作用，目前还未有确切证据。本研究采用去卵巢大鼠子宫增重实验和大鼠子宫内膜增殖实验探讨HgCl2和CdCl2及二者联合应用的雌激素样作用，为进一步研究其生殖发育毒性作用机制提供理论依据。

1材料与方法

1．1试剂和仪器

HgCl2，分析纯，北京化工厂。CdCl2，分析纯，中国亭生化学试剂厂。雌二醇(estradiol，E2)，Sig-ma公司产品。核仁组成区相关嗜银蛋白(argyro-philicnucleolarorganizerregion-associatedproteins，Ag-NORs)银染工作液的配制:用体积分数为10%的甲酸配制体积分数为2%的明胶溶液，再将明胶溶液与体积分数为50%的硝酸银按体积比1∶2混合即成。868045型普通光学显微镜(日本Olympus公司)，切片机(湖北徕克医疗仪器有限公司)、电子天平(德国Sartorius公司)。

1．2动物和去卵巢大鼠模型的建立

成年雌性SD大鼠66只，体重210～230g，由河南省实验动物中心提供，动物许可证号:医动字第410117号。饲养环境温度为18～22℃，湿度60%～70%，昼夜周期为12h/12h，普通饲料饲养，自由饮水进食。将性成熟雌性SD大鼠实验室适应3d后，称重，剪毛，ip给予2%戊巴比妥钠2．0ml•kg－1麻醉成功后，腹卧位固定，用碘酊消毒手术区皮肤，沿背中线切开皮肤，切口上端达最后一肋骨处，下端止骶骨。脊柱两侧切开肌层，到达腹腔，取出子宫和卵巢，分离脂肪组织，暴露输卵管，沿输卵管处切除卵巢，复位子宫，缝合切口，ip给予庆大霉素1ml，防止动物手术后感染。去卵巢SD大鼠于手术后第3天，每只大鼠行阴道涂片，连续5d，即用棉签蘸少量生理盐水，插入阴道内轻轻旋转两圈，取出，在玻璃片上涂抹数次，于低倍镜下观察白细胞和角化上皮细胞出现情况，判断卵巢摘除是否完全。连续涂片5d，镜下均见大量白细胞和少量黏液，未见典型的角化上皮细胞出现判定为卵巢摘除完全;若有大量的典型角化上皮细胞出现，而只有少量的白细胞出现判定为卵巢摘除不完全。

1．3动物分组及给药

按参考文献［7］将完全摘除卵巢的大鼠，于术后第8天随机分为11组，每组6只，分别为去卵巢模型对照组(给予生理盐水);E20．08mg•kg－1(阳性对照组)，以花生油为溶剂;HgCl20．04，0．20和1．00mg•kg－1组;CdCl20．08，0．40和2．00mg•kg－1组，HgCl2+CdCl2(0．04+0．08)，(0．04+0．40)和(0．04+2．00)mg•kg－1，给药容积为2．0ml•kg－1，每天ip给予1次，连续3d。

1．4取材和制片

最后一次给药后24h，称重，颈椎脱臼处死大鼠，处死前2h每只大鼠ip给予秋水仙碱4mg•kg－1，使细胞分裂停滞于有丝分裂中期。迅速取出子宫，称质量后，于子宫中段垂直于子宫角长轴朝子宫体方向切取约1cm子宫组织，经Bouin固定液固定，在24h内，用体积分数为70%乙醇洗涤直至苦味酸的黄色消失。常规石蜡包埋，一半切片进行常规HE染色;另一半进行硝酸银染色。

1．5子宫脏器系数测定

准确称量子宫质量(g)和体重(g)，子宫脏器系数=子宫质量(g)/体重(g)×100。

1．6有丝分裂指数测定

参照文献［8］在油镜下，常规HE染色的每个切片随机选取10个视野，每个视野计数40个子宫内膜腺体细胞，记录处于有丝分裂的细胞数，按下式计算有丝分裂指数(mitoticindex，MI)(%)=有丝分裂细胞数/观察细胞数×100%。每只大鼠观察2张切片，结果取平均值。

1．7Ag-NORs颗粒数观察

Ag-NORs颗粒为黑色颗粒，位于核仁中与细胞核内(细胞核背景呈淡黄色)。在油镜下，每个切片随机选取10个视野，每个视野计数40个染色均匀、背景清晰的细胞，计数Ag-NORs颗粒数，并计算每个细胞Ag-NORs颗粒数。每只大鼠观察2张切片，结果取平均值。

1．8统计学分析

子宫脏器系数和有丝分裂指数用x珋±s表示，均数之间的多重比较，采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD方法。Ag-NORs颗粒数用中位数表示，组间比较用非参数检验进行统计学分析。

2结果

2．1HgCl

2或CdCl2及二者联合对去卵巢SD大鼠子宫的增重作用表1结果表明，与去卵巢模型对照组比较，HgCl21．00mg•kg－1组、CdCl22．00mg•kg－1组及HgCl2+CdCl2(0．04+0．08)和(0．04+2．00)mg•kg－1组大鼠的子宫脏器系数明显升高(P＜0．05);与相应剂量CdCl2组比较，HgCl2+CdCl2(0．04+0．08)mg•kg－1组的子宫脏器系数明显升高(P＜0．05)。

2．2HgCl

2或CdCl2及二者联合对去卵巢SD大鼠子宫内膜细胞有丝分裂指数的影响表2结果显示，与去卵巢模型对照组相比，除了CdCl20．08mg•kg－1组外，其余各组大鼠的MI有明显差异(P＜0．05);与相应剂量CdCl2组比较，HgCl2+CdCl2(0．04+0．08)和(0．04+0．40)mg•kg－1的MI值明显增高(P＜0．05)。

2．3HgCl

2或CdCl2及二者联合对去卵巢SD大鼠子宫内膜细胞Ag-NORs颗粒数的影响表3结果显示，与去卵巢模型对照组相比，HgCl21．00mg•kg－1组、CdCl22．00mg•kg－1组及HgCl2+CdCl2(0．04+0．08)和(0．04+2．00)mg•kg－1组的去卵巢大鼠子宫内膜Ag-NORs颗粒数有明显增高(P＜0．05);与相应剂量的CdCl2组比较，仅HgCl2+CdCl2(0．04+0．08)mg•kg－1组的差异具有统计学意义(P＜0．05)。

3讨论

子宫增重实验是最早建立的检测雌激素活性的经典方法，目前仍被广泛应用。大鼠去卵巢后，当给予其雌激素样物质后，能诱导靶细胞增殖与分化，表现为子宫重量增加，测定子宫重量或子宫脏器系数，就能够反映雌激素活性和强度［9－10］。在去卵巢SD雌性大鼠子宫增重实验中，阳性对照雌二醇组子宫脏器系数明显高于去卵巢模型对照组。HgCl2组和CdCl2组子宫脏器系数呈剂量-效应关系，但经单因素方差分析，仅高剂量组与去卵巢模型对照组相比，有显著差异(P＜0．05)，与申立军等［7］和Hfer等［11］研究结果一致，进一步证明了HgCl2和CdCl2在高剂量时具有雌激素活性。Soto等［12］亦认为子宫增重实验所采用的子宫重量变化等指标的敏感性不够。为此，本研究选用去卵巢大鼠子宫内膜增殖实验，根据MI的变化来判断细胞的增殖速率、细胞周期和有丝分裂时间［8］。本研究结果显示，与去卵巢模型对照组相比，除HgCl20．04mg•kg－1组外，HgCl2和CdCl2各剂量组MI均明显增加，且随着染毒剂量的增加而递增(P＜0．05)。此实验结果佐证了HgCl2和CdCl2具有雌激素活性。

核仁组成区(nuclearorganizerregion，NOR)具有嗜银性，因此可以用胶体银染色技术加以检测。Ag-NORs是被硝酸银染色的NOR区，由某些染色体上聚集的蛋白质组成［13］(即具有转录活性的r-DNA区域周围的酸性非组蛋白(B23蛋白和C23蛋白))，主要生物学功能为参与调控核糖体前RNA的转录、加工和装配或调节RNA聚合酶Ⅰ亚单位，起维持RNA链伸展的作用，可以反映核仁结构与功能的变化，还可以作为细胞r-DNA转录活性的标志物［14］，是反映细胞增殖的良好指标。本研究通过Ag-NORs这个敏感指标，观察HgCl2与CdCl2的雌激素活性。结果表明，HgCl2和CdCl2各剂量组Ag-NORs呈剂量-效应关系;与去卵巢模型对照组相比，高剂量HgCl2组和CdCl2组Ag-NORs有明显差异(P＜0．05)，亦佐证了HgCl2和CdCl2在高剂量时具有雌激素活性。去卵巢SD大鼠子宫增重实验和Ag-NORs颗粒数实验中，HgCl20．04和0．20mg•kg－1未表现出雌激素活性，CdCl20．08和0．40mg•kg－1亦未表现出雌激素活性。

HgCl20．04mg•kg－1和CdCl20．08mg•kg－1均不能提高去卵巢SD雌性大鼠子宫脏器系数，但二者联合作用后，能够提高去卵巢SD雌性大鼠子宫脏器系数，与去卵巢模型对照组和CdCl2相应剂量组相比差异显著(P＜0．05)，说明二者联合具有雌激素活性，提示二者能够产生联合效应。未显示雌激素活性剂量的HgCl2与各剂量CdCl2混合后的子宫脏器系数均比相应剂量CdCl2组的子宫脏器系数增加，说明低剂量HgCl2能够提高CdCl2各剂量组雌激素活性，尤其(HgCl2+CdCl2)低剂量组与相应剂量CdCl2组相比，差异有统计学意义(P＜0．05)，说明未显示雌激素活性剂量的HgCl2可使不显示激素活性剂量CdCl2显示雌激素活性。二者之间能够产生联合作用，可能与HgCl2和CdCl2同为二价重金属，具有相似的作用机制和靶位点有关。

去卵巢子宫内膜细胞增殖实验亦表明，HgCl20．04mg•kg－1能够明显提高CdCl2各剂量组MI值(P＜0．05)。与相应剂量的CdCl2组比较，中、低剂量组的有明显差异(P＜0．05)，说明HgCl2能够增强CdCl2的雌激素活性，使原本未显示雌激素活性剂量的CdCl2表现有雌激素活性，而高剂量CdCl2雌激素活性增加不明显，但仍具有明显的雌激素活性。

HgCl20．04mg•kg－1能够提高CdCl2各剂量组Ag-NORs颗粒数，与相应的CdCl2组比较，仅低剂量组的差异具有统计学意义(P＜0．05);但与去卵巢模型对照组相比，高、低剂量组有明显差异(P＜0．05)。同样说明了低剂量HgCl2能够增强CdCl2的雌激素活性，使原本未显示雌激素活性剂量的CdCl2表现有雌激素活性剂量。本研究中，子宫增重实验、子宫内膜细胞有丝分裂指数和子宫内膜细胞Ag-NORs颗粒数三项指标结果均能证明未显示雌激素活性剂量的HgCl2可使不显示激素活性剂量CdCl2显示雌激素活性，说明了二者有联合作用。但上述三项结果均为HgCl2+CdCl2(0．04+0．40)mg•kg－1最低，可能由于样本量小，需要进一步的实验研究。

本研究提示环境雌激素之间能够产生联合作用，特别是低剂量时联合作用更加明显，即使是以未显示雌激素活性的剂量混合，仍然能够显示出雌激素活性。事实上，在环境中HgCl2和CdCl2多以较低浓度混合存在，如单独研究其中一种物质在较低剂量时的雌激素样作用，往往会发现它们对生物体几乎不产生任何损害作用。人类在生活、生产中，往往同时或相继接触二者，当以无雌激素样作用剂量或低雌激素样作用剂量混合进入机体后，一部分经代谢排出，但大部分能够在体内蓄积，产生联合作用。另外，HgCl2和CdCl2具有不易降解、残存期长等特点，因而应广泛关注其危害。