城市回用水细胞毒性研讨范文

作者：姜淑卿邸金茹王春花何宁李新刘英华刘克明单位：天津市疾病预防控制中心毒理室

城市典型环境水与居民的生活息息相关，其主要包括饮用水源水、城市回用水、自然水体水及市政景观水等。伴随着生产和生活污水废水的排放，环境水不可避免会受到多种有害物质的污染，对生态环境及人类健康产生直接和间接影响。目前环境致突变物的潜在风险被普遍关注[1]，尤其是水中的有机污染物可导致DNA的损伤，引起DNA突变，若突变未被正常修复，就会产生相应的遗传效应，从而启动致癌过程。本研究采集某市典型环境水（饮用水源水、城市回用水、流经河水及公园景观水水样）对其中有机提取物的细胞毒性和致突变性进行了初步探讨，以期为水环境的治理和水资源的合理利用提供科学依据。

1材料与方法

1.1主要仪器与试剂自动固相萃取仪（美国Zymark），R-200型旋转蒸发器（瑞士Buchi公司），固相萃取柱（3ml，500mg，英国InternationalSorbentTechnology公司），JJT型生物洁净工作台（北京半导体设备一厂），3110型CO2培养箱（美国Thermoforma公司），紫外可见分光光度计（北京通用仪器设备有限公司）。甲醇[分析纯，利安隆博华（天津）医药化学有限公司]，硫酸（分析纯，天津市化学式剂三厂），乙酸乙酯（分析纯，天津化学试剂有限公司），无水硫酸钠（分析纯，天津市滨海化工厂），RPMI1640培养粉（美国Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），胰蛋白酶（德国BoehringerMannheimGmblt公司），噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司），L-谷氨酰胺（美国Sigma公司），混合功能氧化酶S9为多氯联苯诱导大鼠后制备的肝匀浆。

1.2水样采集于丰水期采集某市饮用水源水、流经河水、公园景观水及污水处理厂回用水。

1.3水样预处理采集水样后加入1%甲醇溶液抑制微生物生长,加入硫酸调节pH到3左右,0.45μm滤膜过滤水样。调理后将20L水样以5ml/min流速萃取水样。萃取后,萃取柱用空气干燥10～15min,以除去残留的水分。吸附在C18柱上的化合物用2.5ml乙酸乙酯淋洗2次。获取所得萃取物用无水硫酸钠脱去水分,然后旋转蒸发浓缩,最后在35℃水浴用弱氮气进一步浓缩到约1ml。

1.4细胞毒性实验

1.4.1细胞常规培养CHL细胞由天津药物研究院提供。该细胞在含1%青链霉素和10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶消化、传代。取增殖旺盛、状态良好的细胞用于实验研究。

1.4.2剂量分组将常规培养处于对数生长期的CHL细胞配成浓度为4×104个/ml的细胞悬液,加入96孔培养板中，每孔200μl，24h后分别加入相当于原水1000、500、250、125、62.5、31.2ml/ml6个浓度的水样提取物，以DMSO为溶剂对照，同时设不加细胞的空白对照组。

1.4.3吸光度值测定染毒培养24h后分别向各孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，继续培养4h后弃去培养液，每孔加入DMSO150μl终止反应，振荡5min，用酶标仪在492nm、620nm处测量吸光度(A)值。

1.4.4计算半数抑制浓度（IC50）按以下公式计算细胞存活率：细胞存活率（％）＝A试验组/A对照组×100％，用细胞存活率对剂量对数作图法求出IC50。

1.5Ames试验

1.5.1剂量分组试验设相当于原水体积2000、1000、500、250ml/皿4个剂量，用DMSO配制，同时设溶剂对照。阳性对照：敌克松（50μg/皿），2-AF（20μg/皿）。

1.5.2试验菌株TA98、TA100菌种（天津市医药研究所提供），经鉴定遗传特性都符合其规定标准。

1.5.3方法在顶层琼脂中加入0.1ml试验菌株增菌液、0.1ml受试物溶液和0.5mlS9混合液（当需要代谢活化时）。混匀后倒入底层培养基平板上，每个剂量及对照均做3个平行样，并重复试验一次。在37℃培养48h，计数每皿回变菌落数、突变率（MR，受试物回变菌落数与空白对照菌落数比值）；MR≥2，且具有剂量-反应关系者定为阳性。

1.6统计学分析采用Excel2003软件进行统计学分析。

2结果

2.1细胞毒性实验结果如表1、表2所示，随染毒剂量的增加，各种环境水有机提取物均引起CHL细胞存活率的降低。水源水、城市回用水、河水、景观水细胞毒性的IC50分别为550、90、250、500ml/ml。

2.2Ames实验结果在无代谢活化系统下，城市回用水在500ml/皿及以上两菌株回变菌落数均超过自然回变菌落数的2倍（表3）；河水在1000ml/皿(表4)两菌株回变菌落数为自然回变菌落数的2倍以上,且有剂量-反应关系；景观水在2000ml/皿（表5）菌株TA98回变菌落数为自然回变菌落数的2倍以上；水源水（表6）未见致突变性。在有代谢活化系统下，城市回用水两菌株在500ml/皿、河水在1000ml/皿两菌株回变菌落数为自然回变菌落数的2倍以上,且有剂量-反应关系；水源水及景观水未见致突变性。

3讨论

水体有机物污染严重威胁生态坏境和人类的生命安全，由于工农业生产和生活污水的长期排放，地面水常被各种有机物污染，如多环芳烃、多氯联苯和农药等。我国经济快速增长工业化发展以及城市化的进程加剧了江河湖泊的水污染。从对人体健康的危害和生态平衡的破坏性来看，有毒有机污染物在环境中往往具有长效性，不易降解，可通过生物链蓄集，且对环境的破坏和人体健康的危害多具不可逆性，对人类健康构成严重威胁。

本研究采集某城市典型环境地面水中的城市回用水、河水、景观水和水源水进行细胞毒性和致突变实验。结果显示，随染毒剂量的增加，各种环境水有机提取物均引起CHL细胞存活率的降低，水源水、城市回用水、河水、景观水细胞毒性的IC50分别为550、90、250、500ml/ml，说明回用水的细胞毒性最大，河水次之，而水源水和景观水的细胞毒性最小。Ames实验发现，在无代谢活化系统下，城市回用水在500ml/皿、河水在1000ml/皿、景观水在2000ml/皿两菌株回变菌落数为自然回变菌落数的2倍以上,且有剂量-反应关系。在有代谢活化系统下，城市回用水两菌株在500ml/皿回变菌落数为自然回变菌落数的2倍以上，且有剂量-反应关系；河水在1000ml/皿两菌株回变菌落数为自然回变菌落数的2倍以上,且有剂量-反应关系；水源水及景观水未见致突变性。说明回用水和河水在代谢前后均有致突变性，且作用大小变化不大，河水的致突变性稍弱于回用水，景观水经代谢活化后致突变性消失，景观水没有致突变性。各种水体的致突变性强弱与其细胞毒性排序相近。

近年来，城市排放污水回用的可行性研究得到了世界各国政府及学术界的广泛关注[2]，其环境致突变物的潜在风险尤其成为关注焦点。本课题组经DNA断裂试验证实随着回用水剂量的增加，对质粒的损伤作用也明显增加，差别有统计学意义（P<0.05）。基因测序法证实城市回用水有机提取物能诱导人胚肝细胞(L-02细胞)p53基因突变[3,4]，证明T市回用水处理后仍存在致突变物，可能由于工艺流程设计上的原因，城市污水厂处理污水的过程中产生了新的致突变物质，如朱凤鸣等[5]在对自来水的研究中发现，氯化消毒过程中，可产生致突变物卤代烃,表现出一定的致突变性。水源水和景观水虽未见致突变性，但存在一定的细胞毒性，河水的致突变性与回用水相近，说明有污染的可能性，提示相关部门存在管理上的欠缺。

综上所述，T市回用水、河水和景观水在一定浓度及条件下有致突作用，为降低其潜在的人类致癌风险，确保城市用水人群的安全性，有必要对致突变物质的种类、复合作用机制及去除方法问题进行更加深入细致的研究。