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急性早幼粒细胞白血病实验室诊断

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摘要:

目前,急性早幼粒细胞白血病的实验室诊断主要是以细胞形态学检查为基础,结合免疫学、细胞遗传学以及分子生物学检验的MICM综合性诊断技术。近几年,D-二聚体在急性早幼粒细胞白血病中的诊断价值也逐渐被临床重视。本文将对这些实验室诊断方法进行综述。

关键词:

急性早幼粒细胞白血病;MICM分型;D-二聚体;FISH;FCM

急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL)是急性髓细胞白血病(acutemyeloblasticleukemia,AML)的M3亚型[1],多伴有异常染色体t(15;17)而形成PML-RARα融合基因。以异常早幼粒细胞增生为主,临床上除有发热、感染、贫血和浸润等急性白血病的症状外,广泛而严重的出血常是本病的特点,易并发弥散性血管内凝血(DIC),可发生原发性纤溶亢进。经诱导化疗或骨髓移植后达到临床完全缓解(CR),但体内依然会残存约106~108个微量白血病细胞(MRLC),即微量残留白血病(minimalresiduaidisease,MRD)[2],而这些细胞则是APL复发的根源。近年来,随着分子生物学技术的迅猛发展,通过联合测定PML-RARα融合基因进行诊断,即将形态学(morphology,M)、免疫学(immunology,I)、细胞遗传学(cytogenetics,C)和分子生物学(molecu-lar,M)相联合的MICM分型技术[3],极大地提高了APL诊断的准确率,并为MRD提供了更为可靠的诊断依据。本文结合近几年相关学者利用MICM分型技术和D-二聚体检测等在APL上的诊断报道及相应研究成果,对这些诊断方法进行综述,并探讨各诊断方法的优劣。

1血细胞形态学在诊断中的应用

1.1血象APL的血涂片观察,可见血红蛋白和红细胞呈不同程度的减少;血小板中度到重度减少,多数为(10~30)×109/L。白细胞计数大多病例在15×109/L以下,明显减少者见于全血细胞减少,但也可有明显增高(M3v型),分类以异常早幼粒细胞为主,也可见少数原粒及其他阶段粒细胞,胞浆易见Auer小体。

1.2骨髓象多数APL病例骨髓增生极度活跃,个别病例增生低下。各阶段幼红细胞和巨核细胞明显减少,细胞形态分类以早幼粒细胞为主,占30%~90%(NEC),可见少量的原粒和中幼粒细胞。增多的早幼粒细胞形态异常,大小不一,外形呈椭圆形或不规则形。胞核扭曲变形,可见双核,核染色质疏松有明显核仁。胞质中含多量大小不等的嗜苯胺蓝颗粒[4],根据胞质中颗粒的不同可分为3个亚型:粗颗粒型(M3a),颗粒粗大深染密集;细颗粒型(M3b),颗粒密集而细小;变异型(M3v),颗粒极少甚至没有。

1.3细胞化学染色过氧化物酶(POX)、苏丹黑染色(SBB)、酸性磷酸酶(ACP)、非特异性脂酶(NSE)均呈阳性或强阳性;且非特异性脂酶(NSE)不被NaF抑制,中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)积分减低。通过APL细胞的形态学特征而对其进行分型主要依据1976年法(F)、美(A)、英(B)三国协作组提出的急性白血病FAB形态学分型方案及诊断标准(1985年有修改)[5]。借助光学显微镜和一定的细胞化学染色技术,在形态学上对APL做出初步的分型诊断。由于仅是凭借人眼进行分型,其在细胞形态的辨认上易受检验人员学识水平、工作经验等因素影响,从而影响对APL分型的准确性;且灵敏度低,对于MRD的监测也很难实施。近几十年,国际上在白血病FAB分型的基础上又开展了免疫学、细胞遗传学和分子生物学技术的研究工作,大大提高了对白血病诊断的准确性也更利于对MRD的监测[6]。但利用光学显微镜的形态学诊断也一直被临床沿用,主要由于光学显微镜方便易得,成本相对较低,利于普及,特别是基层医院,可以作为白血病筛查的主要手段;且对于细胞形态典型的病例,血细胞形态学诊断更是有利于疾病的及时诊断和治疗。

2免疫学分型在诊断中的应用

典型的APL免疫学表型呈CD13、CD33阳性,CD34及HLA-DR阴性,CD34阳性的APL恶性细胞颗粒小而少,且易出现白细胞计数增高,预后较差[7]。近年来随着单克隆抗体的不断开发及流式细胞术的广泛开展,急性白血病免疫表型研究得到迅猛发展,极大地提高了APL诊断和分型的准确性[8]。同时随着流式细胞仪(FCM)性能的不断完善,也使得MRD的检测更为灵敏。FCM是将单克隆抗体、流体力学、免疫荧光、计算机等技术相结合,测量射门参数在单细胞水平上辨认细胞形态、大小和荧光等特征,其检测快速、简便,特异性好、敏感度高,能对大量细胞进行定量分析,使用的单克隆抗体容易购买,价格相对便宜,便于临床推广。但由于目前缺乏理想的抗体组合,FCM检测APL患者MRD的灵敏度还较低[9];且随着病程发展,细胞表面的抗原发生改变,亦会导致结果假阴性。因此,较多研究中心建议同时采用多种不同的免疫表型会使这种影响降至最低[10]。张红灵等[11]人采用一组四色荧光标记单克隆抗体组合(CD15-CD11b-CD33-CD45)的流式细胞仪对40例初诊时经形态学及流式免疫分型诊断为APL的白血病患者及其治疗后12例骨髓标本进行检测,同时检测正常对照8例。以CD45/SSC选定粒细胞门,选出其中CD33+细胞再进一步分析CD11b及CD15的表达。结果发现CD33+APL白血病细胞群均表达CD15-CD11b-CD33+,有少数病例同时含有少量CD15-CD11b+CD33+分化细胞。而在正常骨髓标本中以CD45/SSC设门粒细胞群CD15-CD11b-CD33+细胞多数为0,以CD15++CD11b++细胞为主,少数表达CD15+CD11b++,CD15+CD11b+,CD15++CD11b+和CD15++CD11b-细胞,表现出与白血病早幼粒细胞明显不同的表型。因此四色组合FCM可用于APL中MRD的检测。

3细胞遗传学在诊断中的应用

约70%~90%的APL具有特异染色体t(15;17)易位,形成PML-RARα融合基因,这是APL特有的细胞遗传学标志[12]。PML-RARα产物可抑制RARα-RXR二聚体,进而使早幼粒细胞分化成熟障碍[13]。临床上全反式维甲酸ATRT诱导分化治疗能使85%左右的APL患者获得缓解,预后较好;极少数无此融合基因者,维甲酸治疗不敏感,预后较差。常规细胞遗传学中的染色体检验主要包括染色体显带/非显带技术、染色体高分辨技术和染色体脆性部位显示技术等。侯继申等人[14]研究表明APL的细胞遗传学与形态学的相关性并不总是一致的。少数具变异易位核型、变异型APL患者常表现不典型的形态学特征,易误诊为其他白血病。其研究的39例APL患者中有2例APL初诊时被误诊为M2和M5,其中1例早幼粒细胞胞质内富含多个空泡、颗粒稀少,可能与早幼粒细胞颗粒缺失导致空泡形成有关,经核型分析确诊。因此常规染色体核型分析在形态不典型的APL诊断中具有重要作用,可提高APL诊断的准确性和灵敏度。常规染色体核型分析作为经典的分析细胞遗传学方法,已研究的较为成熟,由于着眼于所有染色体因此容易发现新的染色体异常,其主要不足是对于标本质量要求较高,灵敏度较低,容易出现假阴性结果,且对于导致白血病复发的微小残留病监测较不敏感[15]。

4分子生物学检验在诊断中的应用

4.1荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术(FISH)是一种高分辨率和高灵敏度的染色体和基因分析技术[16],通过将生物素标记的DNA探针与互补的DNA链染色体原位杂交,荧光显色后显微镜观察,其将细胞遗传学和分子生物学检测技术充分结合,不仅用于分裂中期细胞,还可用于细胞分裂间期,拓展了检测范围,提高了白血病诊断和MRD检测的灵敏度[17]。郑玲等人[18]利用多重荧光原位杂交(M-FISH)技术对20例APL患者进行检测,并与常规细胞遗传学和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)结果相比较,从而揭示了M-FISH对于APL的诊断及其MRD的检测有重要应用价值:M-FISH虽不如RT-PCR敏感,但其反映的是处于增殖期的单个白血病细胞的状况,通过反复检测可以动态地观察体内白血病细胞负荷的消长,似比RT-PCR更能预测白血病的复发。同时GordonDewaldW[19]在其报道中表明FISH还可以检测一些变异型的RARα融合基因,且检测效率高,利于标准化开展。

4.2聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)是一种用于体外扩增核酸片段的技术[20],在进行APL检测时目前临床常用的是逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及在PCR反应体系中加入了荧光基团的实时荧光定量PCR(RQ-PCR)[21]。赵威等人[22]利用实时定量PT-PCR技术可检测出10-5μg人急性早幼粒细胞白血病细胞株(NB4)细胞cDNA中的PML-RARα融合基因,其灵敏度高、重复性好,且有助于监测白血病微小残留病灶。实时定量RT-PCR是在普通PCR反应中加入能与PCR产物结合的荧光探针或荧光染料,使之荧光信号随着扩增产物的增加而成比例增长,仪器实时检测每一个循环结束后的荧光强度,通过与标准曲线对比得出定量结果[23],动态监测PML-RARα融合基因,以及PML-RARα亚型[24],来检测APL细胞的残余数量和预测复发,还可以预测白血病患者的治疗反应,从而成为指导临床个体化治疗、预防复发和提高患者生存率的重要手段。

5D-二聚体检测在APL中的临床价值

近年来,D-二聚体在帮助诊断凝血系统和纤溶亢进,特别是继发性纤溶亢进等方面的临床价值越来越受到医学专家的重视[25]。急性早幼粒细胞白血病(APL)在疾病进程和治疗期最常见的临床表现是广泛而严重的出血[26],甚至出现颅内出血,且易并发弥散性血管内凝血(DIC),从而继发纤溶亢进。究其原因,有研究表明因为APL的异常早幼粒细胞具有合成释放大量促凝物质的能力,如组织因子,这些促凝物质会激活凝血系统,引起继发性的纤溶功能亢进,当这些细胞增多到一定程度时,血液将呈现为高凝状态,机体内微循环广泛形成血栓,进一步促进继发性纤溶亢进,造成严重出血等并发症状。因而血浆D-二聚体的检测对APL有一定的诊断意义。董大鹏等人[27]通过临床上72例APL患者治疗前和治疗后D-二聚体含量检测结果分析得出该指标有较高的灵敏度,能够较好的反应早期患者体内的纤溶亢进及凝血系统激活状态。通过检测患者血D-二聚体含量可以直接反映D-二聚体水平和患者病情的变化情况,因此能够作为APL病情进展及预后的重要参考指标[28],且该指标的检测在临床上简便、快速、成本低,利于普及。但值得注意的是,任何引起DIC的疾病都会导致D-二聚体的增高,因此缺乏特异性,一般只作为APL继发DIC诊断的实用性指标[29]。

综上所述,APL的实验室诊断方法已不单靠FAB形态学分型,免疫学、细胞遗传学以及分子生物学的发展,为白血病的诊断,特别是MRD的诊断,提供了更精确,更敏感,更为标准化的检测技术。这不仅使我们对APL的本质、发病机制和生物学特性有了进一步的了解,而且对指导临床治疗和判断预后复发更是具有相当大的临床实用价值。而FCM、FISH、PCR等这些技术的应用虽然大大提高APL诊断敏感性,但由于其对仪器和试剂的要求条件高、成本高,且检测周期较长,目前在临床较难完全普及。而针对APL,由于其更易并发DIC,D-二聚体的检测虽然特异性不强,但在于其成本较低,敏感性较高,也逐渐被临床所重视。因此在节约成本、减少诊断时间、为患者争取宝贵的治疗时间上,APL的实验室诊断方法依然还有更广阔的研究空间[30]。

作者:薛白 李靖 王奔放 单位:江苏护理职业学院 江阴人民医院检验科

急性早幼粒细胞白血病实验室诊断责任编辑:杨雪    阅读:人次