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人乳头瘤病毒感染与结直肠癌相关性研究

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摘要:目的检测195例结直肠癌样本中人乳头瘤病毒(HPV)的感染情况。方法利用通用PCR法检测结直肠癌样本中的HPVDNA,随后用荧光定量PCR和直接测序法对HPVDNA阳性样本进行HPV分型,同时统计HPV阳性标本的Kras、PIK3CA和BRAF基因突变情况和临床病理特征。结果结直肠癌标本中HPV感染阳性率为17.94%(35/195),以HPV16、18型感染为主,且存在混合感染;HPV感染阳性标本中Kras基因突变率为42.85%,PIK3CA、BRAF基因突变率均为2.86%,HPV感染与三个基因突变的相关性均无统计学意义;阳性标本中以右半结肠的癌变居多,癌组织以中分化为主,临床Ⅱ期多见,多无淋巴结的转移。结论HPV感染可能与结直肠癌的发生有关,但与Kras、PIK3CA、BRAF基因突变无关。

关键词:人乳头瘤病毒;结直肠癌;通用PCR;突变

结直肠癌已成为最常见的恶性肿瘤之一,近年来,国内外有研究表明结直肠癌的发生可能与人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)的感染有关,但一些研究结果的检出率低或未检测到HPV病毒,这可能与人群种族、标本来源、标本数量及检测方法有关。另有资料显示Kras、PIK3CA和BRAF基因突变与结直肠癌的发生密切相关。因此本研究利用针对HPVL1区通用引物的PCR法检测结直肠癌样本中HPV⁃DNA的存在情况,并用荧光定量PCR和直接测序法对HPV阳性样本进行分型,同时调查Kras、PIK3CA和BRAF基因突变与结直肠癌HPV感染的相关性。

1材料与方法

1.1样本来源

收集2014年7月至2016年6月共195例结直肠癌标本,均来自广州医科大学附属肿瘤医院住院手术病人。其中男性114名,女性81名,中位年龄62岁。

1.2主要试剂和仪器

人乳头瘤病毒检测试剂盒和人乳头瘤病毒核酸分型荧光PCR检测试剂盒购自潮州凯普生物化学有限公司;DNA提取试剂盒、Kras基因突变检测试剂盒、PIK3CA基因突变检测试剂盒和BRAF基因突变检测试剂盒购自厦门艾德生物医药科技有限公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;超微紫外可见分光光度计购自美国Thermofisherscientific公司;PCR扩增仪购自美国ABAppliedBiosystems公司;ABI7500荧光定量PCR仪购自美国Life公司。

1.3方法

1.3.1肿瘤组织DNA提取

组织切片经病理评估合格后,严格按照厦门艾德生物医药科技有限公司的DNA提取试剂盒说明书进行肿瘤组织DNA提取。所提DNA经微量紫外分光光度计检测提取质量和浓度,DNA的A260/A280在1.8~2.0之间,DNA-20℃保存。

1.3.2通用PCR法筛查

PCR反应体系共25μl,包括23.25μlPCR混合液、0.75μlDNATaq酶、1μlDNA模板。阳性对照为HPV18克隆质粒,内参为globin基因,阴性对照为ddH2O。反应条件为95℃预热9min,95℃20s,55℃30s,72℃30s,40个循环,最后72℃延伸5min。

1.3.3荧光定量PCR法HPV分型

荧光定量PCR反应体系共25μl,包括17.50μlPCR混合液、0.50μlDNA聚合酶、2μlDNA样本。反应条件为:95℃预热10min,95℃15s,60℃60s,45个循环,最后38℃延伸5s。荧光信号采集点设在60℃60s,仪器运行中进行实时荧光定量检测,仪器运行结束后直接在荧光定量PCR检测仪上读取荧光值。当空白对照Ct值下显示为Undet,阳性对照Ct值≤36,实验才视为有效。

1.3.4琼脂糖凝胶电泳

配制2%琼脂糖凝胶,取PCR扩增产物5μl与1μlLoddingBuffer混合后,加入凝胶板上的加样孔。电压120V/cm,电泳30min。电泳完毕取出凝胶,采用凝胶成像分析系统分析结果。

1.3.5PCR产物序列测定

将初筛阳性结果切胶回收,使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒提纯出目的DNA片段,用超微紫外可见分光光度计测量回收的DNA浓度。纯化的PCR产物送至潮州凯普生物化学有限公司进行测序。1.3.6Kras、PIK3CA和BRAF基因突变按Kras基因突变检测试剂盒、PIK3CA基因突变检测试剂盒和BRAF基因突变检测试剂盒操作说明进行加样,三个项目都可用同一个程序,PCR反应参数如下:95℃5min,1个循环:95℃25s,64℃20s,72℃20s,15个循环;93℃25s,60℃35s,72℃20s,31个循环。在第三阶段60℃收集信号。

1.4统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计分析,分析HPV阳性标本与Kras、PIK3CA和BRAF基因突变关系用配对四格表的χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1通用PCR法筛查HPV⁃DNA检测结果

通用PCR法筛查195例结直肠癌标本,初筛阳性的标本35例,初筛阳性率为17.94%(35/195)。结直肠癌PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后,结果显示在450bp出现目的条带。

2.2荧光定量

PCR和直接测序法检测HPV⁃DNA对HPV初筛阳性的标本进行荧光定量PCR和直接测序,证实均存在HPV感染,以HPV16、18型感染为主,且存在HPV混合感染。2.3HPV感染与Kras、PIK3CA和BRAF基因突变的相关性HPV感染阳性标本中Kras基因突变率为42.86%(15/35),PIK3CA基因突变率为2.86%(1/35),BRAF基因突变率为2.86%(1/35)。在结直肠癌病例中,HPV感染率分别与Kras、PIK3CA和BRAF基因的突变率比较,差异均无统计学意义、(P>0.05),说明HPV感染与三个肿瘤驱动基因的突变可能无关,见表2。2.4HPV感染与结直肠癌病理特征的关系HPV感染阳性标本中以右半结肠的癌变居多(23/35),其次为直肠(10/35);癌组织以中分化为主(32/35);临床分期以Ⅱ期多见(19/35),其次为Ⅳ期(8/35);病例中多无淋巴结的转移(25/35)。

3讨论

HPV病毒是一种嗜上皮细胞病毒,主要感染皮肤黏膜的上皮细胞,与上皮来源肿瘤的发生、发展有关。HPV病毒DNA由上游调节区(URR)、早期转录区(E区)和晚期转录区(L区)组成。其中E区包括6个开放阅读框,依次为E1、E2、E4、E5、E6、E7,与肿瘤的发生有关。L区包括L1、L2,其中HPV⁃DNA的L1区为最为保守的区域。在宫颈癌中,HPV检出率达到90%以上。近年国内外有研究报道HPV感染与结直肠癌的发生有关,但相关的研究结果差异较大。Li等采用基因芯片方法检测结直肠腺癌,HPV感染率为48.4%;Bernabe⁃Dones等采用巢式PCR方法在西班牙浸润性结直肠癌检出率为42.2%;Burnett⁃Hartman等采用实时荧光定量PCR的方法在西雅图555例结直肠癌标本中检出率只有2%;Gazzaz等用杂交捕获的方法检测,结果显示阳性率为0.8%。其原因可能与人群种族、标本来源、标本数量及检测方法相关,同时病理标本经石蜡的包埋后会造成DNA的降解,造成阳性率降低也是不容忽视的。在Lorenzon等报道中,虽然HPV⁃16在结直肠感染率达到57.1%,但其用含有完整游离HPV16基因的细胞株作比对,对阳性标本中HPV⁃16基因进行相对定量,却发现非常低的量在组织中,其认为不排除从肛门或临床处理过程中污染的结果。

认为病毒将其E6、E7基因整合到癌细胞的DNA中,其余基因大多数丢失或者呈游离状态,以E6、E7以外的基因为目的区域进行检测将导致低阳性率或出现阴性结果。HPV病毒的检测方法有原位杂交、基因芯片法以及以PCR为基础的检测方法等。其中原位杂交法敏感性较低,方法费时;基因芯片法灵敏度高,但费用较高;PCR法灵敏度及特异性都较高,且其中的实时荧光定量PCR能进行定量和分型的优点。本研究针对L1区保守区域设计通用引物,通过PCR方法筛选出阳性标本再进行荧光定量PCR和直接测序分型。同时调查Kras、PIK3CA和BRAF基因突变情况与结直肠癌HPV感染是否有关。实验结果显示阳性率为17.94%,HPV感染的主要型别为HPV16、18型,且存在混合感染,提示结直肠癌与HPV感染有一定的关系,这与Laskar等结果是相一致。阳性标本中Kras基因突变率为42.85%,PIK3CA、BRAF基因突变率均为2.85%,HPV感染与三个基因突变的相关性均无统计学意义。综上所述,本研究显示HPV感染可能与结直肠癌的发生有关,但目前没有研究明确表明HPV参与了结直肠癌的发展,HPV感染如何导致结直肠癌的发生还有待进一步的研究。

参考文献:

[1]罗妙玲,徐韫健.结直肠癌KRAS、BRAF及PIK3CA基因突变状态分析[J].热带医学杂志,2016,16(7):843-846.

作者:李志阳1;陈舒颖1;张先言2 单位:1.广州医科大学附属肿瘤医院检验科,2.广东医科大学医学检验学院

人乳头瘤病毒感染与结直肠癌相关性研究责任编辑:冯紫嫣    阅读:人次