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黏膜免疫在抗流行性感冒病毒感染的作用

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皮肤、黏膜组织是人体免疫系统抵御病原微生物的第一道屏障。机体的黏膜组织总面积远大于体表皮肤,并且与体内广泛分布的淋巴组织紧密相连。病原体进入机体引起的感染90%以上与黏膜有关。由于呼吸道、消化道和泌尿生殖道等器官黏膜与外界相通,因此其具有感染病原微生物的高风险。如呼吸道黏膜不仅是流感病毒感染的发生部位,同时也是免疫防御的作用部位。黏膜上皮细胞层覆盖在这些器官的表面,并且构成了一个防止有害、非自身物质入侵的的物理和免疫障碍。此外,大多数黏膜相关器官,除了下呼吸道(即肺部)外都具有“常住菌”,可与机体创建一个互惠互利的环境。因此,黏膜不仅要区分有益和有害物质,而且还要区分“常住菌”和致病菌;保护有利的物质或常驻菌需要,选择地排除有害物质或有害的病原生物。这一机制就是由黏膜免疫系统(MIS)控制的。尽管近十几年来,人们对抗病毒黏膜免疫系统有了一定的认识,但是仍有很多重要的问题值得探究。因此本文以流感病毒侵入呼吸道黏膜进行探讨,侧重分析黏膜局部免疫在呼吸道控制流感病毒感染的功能。

流行性感冒病毒

流行性感冒病毒(Influenzavirus),属于正黏病毒科,有包膜的一种RNA病毒,可引起人类及动物感染。流感病毒分为三型,即甲(A)型流感病毒,乙(B)型流感病毒和及丙(C)型流感病毒。流感病毒的基因组由7个(C型病毒)或8个(A、B型)片段的单股负链RNA构成,每个RNA节段的两端都含有相对保守的非编码序列。流感病毒A型又分许多亚型,目前发现流感病毒包膜上的两个刺突蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)易发生变异,其中血凝素(HA)有15个亚型,而神经氨酸酶(NA)有9个亚型,因此甲型流感病毒具有高度变异性,其引发的感染常呈突发性且传播迅速,通常可造成大流行。如在2009年爆发流行的甲型H1N1流感,最先从美国和墨西哥流行,继而造成全球的大流行,威胁并影响到全世界人民的健康及生活质量[3]。乙型流感病毒一般仅感染人类,其流行趋势为散发或小范围流行。而丙型流感病毒致病性较弱,通常仅感染儿童,多为散发,一般不流行。

流感病毒以复制方式进行增殖,包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装成熟和释放等步骤。流感病毒侵入黏膜上皮细胞依赖于血凝素的凝集素位点与上皮细胞表面的唾液酸的结合,完成吸附步骤,当HA介导病毒包膜与细胞膜的结合,介导病毒衣壳释放进入胞质。在病毒复制过程中,流感病毒表面的HA蛋白首先以前体HA0形式合成,然后经宿主蛋白酶作用水解为二硫键连接的HA1和HA2,才能发挥膜融合的功能。当流感病毒感染宿主细胞时,通过其血凝素(HA1)识别并结合宿主细胞膜表面多糖受体,诱导细胞膜内陷,包裹病毒颗粒形成囊泡,在M2离子通道的作用下,使囊泡内的pH下降,进而引发血凝素(HA2)结构变化,其其N端融合肽(Fusionpeptide,FP)发生移位,进而嵌入到靶细胞膜上,最终介导病毒包膜与靶细胞膜融合,启动病毒在细胞内的复制过程。神经氨酸酶(NA)的活性位点在A、B型流感病毒中都由相同的11个氨基酸残基排列而成。神经氨酸酶是同源四聚体,抗原结构较易发生变异,具有酶活性,可水解唾液酸。因此,在抗甲型流感病毒的药物研究中,它被视为新的药物勒点。神经氨酸酶的存在有利于新装配而成的成熟病毒释放,使得甲型流感病毒病毒能够继续感染其他宿主细胞。基质蛋白抗原性较稳定,是流感病毒中含量最丰富的蛋白质,介于核蛋白与病毒包膜之间,基质蛋白在维持病毒形态和强化病毒包膜结构方面发挥重要作用。另外,还参与协助子代病毒粒子的装配以及调控病毒多聚酶活性。

黏膜免疫在流行性感冒病毒感染中作用

1呼吸道解剖独特性及气道物理屏障功能

哺乳动物的呼吸道系统主要分为上部(从鼻腔和口腔的喉部)和下部(气管和肺)系统。两个气室由声门环境隔开,健康人的下呼吸道基本上是无菌的。因此,一旦微生物定植于下呼吸道和生长在那里,可导致肺炎发生。与此相反,上呼吸道的入口为吸入环境空气中的氧,这部分系统的黏膜表面可接触机会性微生物(如肺炎链球菌和流感嗜血杆菌)和病原微生物(如白喉棒状杆菌和流感病毒),也可接触外环境中的物质,如各种化学物质(如烟雾)和过敏原(如花粉和屋尘)等。呼吸道上皮细胞完整屏障的结构和功能基础分别是细胞间的紧密连接结构和上皮细胞正常的修复功能。由E-钙粘蛋白与闭锁蛋白oc-cludin与胞浆中ZO蛋白结合形成紧密连接,可以阻止吸入的病原微生物或过敏原等大分子物质通过细胞间隙进入体内。上皮细胞具有发达的纤毛和粘蛋白(MUC)。粘蛋白不是均质蛋白质,而是一个家族,由分泌的糖蛋白(MUC5AC和MUC5B等)和膜表面可以作为细胞受体(MUC1、MUC4MUC11,MUC13,MUC15和MUC20)组成。流感病毒感染宿主细胞是通过其包膜表面刺突蛋白血凝素与宿主细胞表面上的糖链受体唾液酸共同介导的。由于流感病毒对宿主细胞表面糖链受体的识别具有特异性,因此流感病毒感染具有明显的组织亲嗜性,如人流感病毒主要识别末端为唾液酸α2-6半乳糖的糖链受体,该受体主要存在于人呼吸道上皮细胞表面,而禽流感病毒主要识别末端为α2-3的糖链受体,该受体广泛存在于禽类的黏膜上皮细胞表面。粘蛋白主要是α2-3唾液酸化,呼吸道上皮细胞分泌的粘液层富含大量的唾液酸粘蛋白;通过模仿唾液酸化的细胞表面的受体抑制病毒进入[13]。在支气管,粘液和纤毛运动共同作用,可以防止大的异物(>5mm)漂流进入肺泡,这种机制被称为粘液纤毛清除功能,是重要的防御机制。

2呼吸道黏膜局部免疫细胞作用

流感病毒的主要靶标是呼吸道上皮细胞。流感病毒感染首先激发呼吸道黏膜局部固有免疫应答,通过活化固有效应细胞、分泌固有免疫分子发挥限制病毒扩散的作用。这种作用快速,但缺乏特异性和记忆形成。

2.1识别流感

病毒感染的固有免疫细胞的受体病毒感染早期,机体固有免疫细胞通过模式识别受体(PRRs)识别病毒表面的病原相关分子模式(PAMP),进而诱导固有免疫,并通过多种信号转导途径促进体内专职抗原提呈细胞树突状细胞(DC)生成Ⅰ型干扰素等细胞因子,趋化因子等,发挥遏制病毒复制的功能。其中Toll样受体(TLR)是机体主要的PRR,共有11个家族成员,其中TLR2、TLR4能够识别革兰阳性和革兰阴性细菌成分,而TLR3、TLR7、TLR8、TLR9则主要识别病毒蛋白或其核酸和核内体成分。其他PRR,如RNA螺旋酶视黄酸诱导基因Ⅰ和激酶双链RNA活性蛋白激酶R均能识别双链RNA(dsRNA)而参与抗病毒感染。其中在细胞内的内涵体和内质网上表达的TLR3,TLR7,TLR8和TLR9,主要负责识别病毒的核酸组分。TLR3是最早发现能特异性地识别双链RNA(dsRNA)的一种模式识别受体。当病毒在生物合成过程中可启动dsRNA的合成,感染病毒的濒死细胞亦会释放dsRNA,这些dsRNA就会成为病原相关分子模式,也是机体感染状况的预警指标,因此TLR3在抗病毒免疫反应中发挥着很重要的作用。TLR7/8位于细胞内膜,当病毒进入细胞质,在吞噬溶酶体的高度酸化环境影响下,病毒的衣壳成分被破坏,释放出ssRNA,从而激活TLR7和TLR8。Lund等证实ssRNA病毒以TLR7依赖的方式活化树突状细胞。用VSV体外感染野生型小鼠来源的树突状细胞,其IFN-a和IL-12高水平分泌,而TLR7-/-鼠来源的树突状细胞则丧失了对VSV的反应。

2.2巨噬细胞

病毒感染后,固有免疫是机体第一道防线。固有免疫的首要反应之一是巨噬细胞的活化,当巨噬细胞活化后可分泌多种细胞因子和趋化因子,如IL-6、MIP、RANTES等。其中IL-6具有介导白细胞血管内皮细胞的黏附与增加白细胞作用,有助于白细胞的炎性渗出。炎症因子MIP-1和RANTES属于趋化因子家族成员,具有招募血液中的巨噬细胞、中性粒细胞和T淋巴细胞等前炎症细胞的功能,介导其穿过血管内皮细胞到达感染部位。在稳态时,肺泡巨噬细胞表现出相对静止状态,产生细胞因子只有低水平,抑制先天免疫和适应性免疫的诱导。在流感病毒感染的初始阶段,被感染的上皮细胞产生CCL2,通过它们的CCR2受体吸引肺泡巨噬细胞和单核细胞。活化巨噬细胞增强其促炎症细胞因子的反应,包括IL-6和TNF-α。肺泡巨噬细胞具有直接限制病毒传播的的作用,通过诱导吞噬病毒感染细胞[23]和由流感病毒颗粒的巨噬细胞介导的调理吞噬作用,发挥抗病毒作用。它们也参与调节适应性免疫反应。

2.3自然杀伤细胞

自然杀伤细胞(NK细胞)作为介导天然免疫应答的主要淋巴细胞之一,在抗病毒免疫和调节特异性免疫方面发挥着重要的作用。近年来,许多研究表明NK细胞在流感病毒感染早期发挥着重要的作用,其主要通过细胞-细胞直接接触的方式对流感病毒感染细胞的进行杀伤以及通过分泌细胞因子诱导特异性免疫应答。NK细胞可通过其表面的激活性受体NKG2D和NKP46分别与靶细胞表面的ULBPI-3和流感病毒红细胞凝集素结合,同时,NK细胞在I型干扰素(IFN)和白细胞介素-12(IL-12)等细胞因子的刺激作用下活化。NKp46受体是由NK细胞产生用于防止病毒感染的。当细胞被感染的时候,病毒产生的血凝集素蛋白会被NKp46所识别,然后NKp46结合NK细胞的NKp46受体,进而激活免疫,并清除受感染的细胞,从而消灭病毒。缺乏NKp46受体,甲型流感病毒感染小鼠的发病率和死亡率均增加。NK细胞与CD16受体(FcγRIII)可以结合到结合到流感病毒感染的细胞的抗体的Fc部分介导和这些细胞的裂解。这个过程被称为抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

2.4T淋巴细胞

在流感病毒的感染过程中,细胞免疫发挥主要作用。细胞免疫是由T细胞介导,主要依赖CD8+T细胞和CD4+Th1细胞释放的细胞因子。成CD4+T细胞在抗局部或全身病毒感染中起着重要的作用。它通过分泌等细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2等增强CD8+T细胞的作用;促进B细胞产生IgG抗体中和病毒颗粒。CD8+T细胞在病毒感染中,被认为是清除病毒的重要的免疫细胞]。作为研究与类分子联系的表位,采用了以病毒核酸片段在靶细胞内表达的方式,可以直接将病毒的某一编码基因导入靶细胞,使其表达病毒抗原以模拟内源性抗原的呈递过程。研究证明,病毒的构成成分可诱生的抗原表位。

3黏膜免疫效应分子

3.1干扰素(interferon,IFN)

干扰素是一种具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子。根据其结构和生物学功能不同,可将其分为两型。其中I型干扰素包括IFN-α和IFN-β两种类型,具有明显的抗病毒活性。I型干扰素通过受体IFNAR1/2向胞内传递信号。II型干扰素即IFN-γ,主要由巨噬细胞释放的细胞因子IL-12和IL-18诱导产生,其表达局限于免疫细胞如T细胞和NK细胞。IFN-γ主要作为一种重要的免疫调节因子,可将IFN-α/β的抗病毒信号放大,细胞表面识别受体为IFNGR1/2。病毒的病原体相关分子模式被细胞的相关受体识别后,分别经过Toll样受体途径和核酸结合蛋白途径进行信号转导,启动β-干扰素的转录和合成。从感染细胞分泌的β-干扰素与细胞膜上I型干扰素共有的受体结合后,经Jak/STAT信号途径刺激细胞产生一系列具有抗病毒效应的的干扰素刺激因子。其中,IFN-α是第一个被纯化和克隆的细胞因子,最早被试用于临床,并取得明显治疗效果的细胞因子。被广泛地用于抗病毒、寄生虫、原虫和真菌感染,并用于白血病、淋巴瘤等肿瘤的治疗。

3.2抗体

抗体可作用于体液中的游离病毒,减低病毒的感染量,进而减少病毒感染的细胞数。流感病毒蛋白中只有表面糖蛋白HA和NA可以诱导保护性中和抗体,其中特异性HA抗体通过中和病毒达到预防流感的目的,而特异性NA抗体主要作用机制是减少病毒的释放。不同亚型的流感病毒诱导的中和抗体对其他亚型没有交叉保护作用。人流感病毒的至少有5个抗原位点,并且能够诱导中和抗体的产生。流感病毒常常发生抗原漂移事件。流感病毒的抗原漂移逃避了宿主的保护性免疫,而宿主的体液免疫压力又可促进抗原变异。

结语

黏膜表面是病原体入侵机体的主要门户。黏膜免疫系统的重要性正日益受到重视,这方面的研究正方兴未艾,但是仍有很多重要的问题值得探究。例如,流感病毒入侵时机体是如何利用这些错综复杂的信号通路的?作为抵抗病原微生物入侵的第一道防线,抗病毒固有免疫系统与适应性免疫之间存在着怎样的关系?因此充分发挥呼吸道黏膜固有免疫在防御病原体感染的正面效应,确保产生针对流感病毒有效的免疫应答,对于流感的防治有着重要意义。

作者:岳冬辉,李欣,毕岩 单位:长春中医药大学

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