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子宫内膜癌细胞表达纤维蛋白原的检查

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[摘要]目的探讨子宫内膜癌细胞是否表达纤维蛋白原。方法纳入于医院接受子宫切除手术的16例子宫内膜癌患者(内膜癌组),同期4例良性子宫肿瘤切除的病例(对照组),采用Westernblot和qRT-PCR实验,分别检测各子宫内膜组织标本中纤维蛋白原蛋白和三链(a、b、g)mRNA表达水平。结果Westernblot检测结果显示,81.25%(13/16)的内膜癌组标本存在纤维蛋白原蛋白表达,而对照组未观察到其表达;qRT-PCR检测结果显示,内膜癌组有7例标本(43.8%)存在至少一个纤维蛋白原链mRNA的表达,而对照组均未观察到其表达。表达纤维蛋白原mRNA的全部7例标本在Westernblot检测中均呈较高水平表达。结论绝大多数子宫内膜癌细胞具备表达纤维蛋白原的能力,是子宫内膜癌高纤维蛋白原血症的重要来源之一。

[关键词]子宫内膜癌;纤维蛋白原;表达

子宫内膜癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一[1]。近年来子宫内膜癌导致死亡风险急剧上升[2]。因此,深入探讨子宫内膜癌的生物学行为,对改善其诊断和治疗策略具有重要价值。纤维蛋白原是一类340kD的二聚体蛋白,由三种多肽链构成(a、b和g链)。通常认为,纤维蛋白原由肝脏产生分泌,进入血液循环,其浓度为200~380mg/L,半衰期为4d[3]。最近,子宫内膜癌的相关研究显示,术前高纤维蛋白原水平与肿瘤临床分期较晚相关,是患者预后差、生存期短的标志物[4]。然而,肿瘤组织是否产生纤维蛋白原,尚存在很多争议。本研究拟通过Westernblot和qRT-PCR技术检测子宫内膜癌的纤维蛋白原表达情况,探讨子宫内膜癌细胞是否表达纤维蛋白原。

1材料与方法

1.1标本来源

收集2014年1月~2015年4月在医院行子宫切除术的16例子宫内膜癌和4例子宫良性肿瘤患者的子宫内膜组织标本,排除子宫内膜增生患者及慢性炎症性疾病、凝血障碍疾病或其他原因造成的异常纤维蛋白原血症患者。

1.2Westernblot检测

用蛋白裂解液[20mmol/LTris(pH8.0),137mmol/LNaCl,20mmol/L二硫苏糖醇(DTT),1%NP-40.2mmol/L钒酸钠,100μg/ml苯甲基磺酰氟,1μg/ml抑蛋白酶肽]充分裂解组织标本,冰浴30min,12000转/min离心10min。取上清,BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物公司)定量蛋白。取等量蛋白上样,采用12%的SDS-PAGE凝胶电泳,半干式转移法转至硝酸纤维素膜。用5%的脱脂牛奶封闭后,使用相应的抗体杂交后,采用BeyoECLPlus超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物公司),在凝胶成像化学发光检测仪ChemiDocTMXRS+(美国Bio-rad公司)显色检测,GAPDH作为检测内参。

1.3qRT-PCR检测

按照总RNA提取试剂盒(大连宝生物公司)说明书,分别提取组织标本的总RNA,所得RNA纯度经鉴定符合实验要求。使用RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)进行反转录和PCR扩增,GAPDH作为RT-PCR实验的内参。参考文献[5]的方法,并经BLAST验证引物特异性,确定并合成纤维蛋白原a、b、g链的PCR扩增引物(英骏生物技术有限公司,中国上海),序列如表1所示。使用CFX96TMrea-timesystem荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)检测。q-RTPCR切点阈值设置为对照组人群纤维蛋白原相应链均值加上3倍标准差,高于该值即为阳性表达。

1.4统计学方法

应用SPSS19.0统计软件分析数据,计量资料以x±s表示,组间比较采用t检验;计数资料以例和百分率表示,组间比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Westernblot检测结果

16例子宫内膜癌标本中,3例呈现低表达,其余13例(81.3%)呈现中高度表达(图1),而对照组4例标本均未观察到阳性表达,两组阳性表达率有显著差异(P<0.01)。

2.3qRT-PCR检测结果

子宫内膜癌组中,7例(43.8%)存在至少一个纤维蛋白原链mRNA的表达,其中2例(12.5%)表达a链mRNA,5例(31.3%)b链,4例g链(25.0%),4例同时表达b和g链。而对照组未观察到纤维蛋白原链mRNA的表达。表达纤维蛋白原mRNA的全部7例标本在Westernblot检测中均呈较高水平表达。

3讨论

高纤维蛋白原血症参与调控肿瘤恶性生物学行为,可能与肿瘤引发全身炎症反应相关,因此,高纤维蛋白原血症是恶性肿瘤的潜在标志[6]。但是,高纤维蛋白血症的成因却存在争议。本研究通过对子宫内膜癌组织进行Westernblot和qRT-PCR检测,证明子宫内膜癌细胞具有产生纤维蛋白原的能力。体外实验证明,恶性肿瘤细胞能够产生纤维蛋白原[7];临床宫颈细胞、肺癌和肠癌组织的细胞浆内可以检测到纤维蛋白原的mRNA[8-9]。动物实验检测结果也显示,纤维蛋白原缺失的转基因小鼠的肿瘤细胞侵袭迁移能力较弱。研究发现,纤维蛋白和血小板的聚合物,可以庇护肿瘤细胞逃逸免疫细胞的监视[10]。此外,纤维蛋白原可以结合参与新血管生成和细胞增殖的相关因子(如成纤维细胞生长因子2、血管内皮生长因子),从而参与促进肿瘤的生长[11]。此外,纤维蛋白原与肿瘤细胞外基质表达的受体整合素相互作用,从而使转移性肿瘤细胞定植到远处组织[11]。上述研究结果都证明纤维蛋白原在肿瘤转移中发挥重要作用。因此,肿瘤细胞通过表达纤维蛋白原可能导致恶性生物学行为,具有更高的侵袭转移能力。

子宫内膜癌患者的高纤维蛋白原血症与不良预后之间存在显著联系[4],但尚未明确的是纤维蛋白原水平上升导致的血浆高凝状态,是由于肝脏释放纤维蛋白原增加,还是肿瘤本身产生的所致。本研究发现,43.8%的子宫内膜癌患者存在至少纤维蛋白原一个链的mRNA表达,而对照组均无表达。Westernblot分析显示,纤维蛋白原高表达仅见于子宫内膜癌患者,而对照组没有。纤维蛋白原是否可作为鉴别子宫内膜癌良恶性的指标,有待进一步的大样本、多中心、多病变组织的深入研究证实。既往免疫组化和PCR分析支持肿瘤细胞具有合成纤维蛋白原的能力。一项体内研究证实,比较术中肺癌病变肺叶的肺静脉和上腔静脉的血浆,发现肿瘤组织是纤维蛋白原的来源之一[12]。本研究进一步证明,在子宫内膜癌组织,癌细胞具有纤维蛋白原分泌功能,是子宫内膜癌患者血清纤维蛋白原的重要来源之一。但本研究尚未发现纤维蛋白原三链mRNA阳性表达的病例,可能是由于患者数量偏少,或者是情况确实如此,有待扩大样本量进一步的验证。总之,本研究证实了子宫内膜癌细胞具备合成并分泌纤维蛋白原的能力,是患者高纤维蛋白原血症的重要来源。子宫内膜癌细胞分泌纤维蛋白原的相关机制及其治疗价值,是未来研究的重要内容。

作者:雷放;谢先丰

子宫内膜癌细胞表达纤维蛋白原的检查责任编辑:张雨    阅读:人次