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葡萄糖对卵巢癌细胞生长增殖影响

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【摘要】目的葡萄糖是维持肿瘤细胞存活的重要能量来源,有关研究表明低糖与无糖条件有可能抑制肿瘤细胞生长,成为潜在的肿瘤治疗方式。本研究通过给予不同浓度葡萄糖刺激SKOV3与A2780卵巢癌细胞系,分析其细胞增殖、细胞周期与细胞凋亡的改变,探讨葡萄糖对卵巢癌细胞生长增殖的影响。方法在体外配制含不同葡萄糖浓度(0、2.5、5.5、25.0mmol/L)的培养基,分别模拟无糖、低血糖、正常血糖及高血糖水平的体内环境,观察不同葡萄糖浓度对卵巢癌细胞的增殖、凋亡与细胞周期的影响。结果高糖促进卵巢癌细胞SKOV3和A2780的增殖,干预48h后,增殖幅度约为无糖组的1.841~1.942倍;低糖与无糖条件诱导卵巢癌细胞发生G1期阻滞,与高糖组相比,SKOV3细胞G1期比例以(40.699±1.131)%增加至(58.619±2.643)%,A2780细胞以(46.348±2.150)%增加至(54.770±2.475)%;低糖与无糖条件亦诱导细胞凋亡,SKOV3与A2780细胞无糖组中凋亡细胞比例分别为(14.015±0.827)%和(12.930±1.127)%。结论本研究通过探讨葡萄糖对卵巢癌细胞生长与增殖的影响,证明低糖与无糖条件诱导卵巢癌细胞发生G1期阻滞、细胞凋亡并抑制其生长增殖。若进一步给予相应葡萄糖抑制剂干预,可能为卵巢癌的临床治疗提供新思路。

【关键词】卵巢癌;葡萄糖;细胞增殖;细胞周期;细胞凋亡

目前,卵巢癌是妇科恶性肿瘤中引发患者死亡的主要原因[1],约75%的卵巢癌患者在确诊时已处于疾病晚期阶段,该类患者在确诊时多已伴有肿瘤局部侵犯或远处转移等症状,常侵及子宫、肝脏、胸膜等器官,伴淋巴结转移。卵巢癌的基本治疗方案通常包括分期手术或肿瘤减灭术,以及联合铂类药物与紫杉醇的新辅助化疗[2-3]。尽管该一线治疗方案在短期内治疗效果尚可、可获得较高反应率,但大多数卵巢癌Ⅲ期或Ⅳ期患者经治疗后对化疗药物易产生抗药性,其5年生存率<40%[4-5]。因此,急需新的治疗手段来改善卵巢癌患者的生存及预后情况。流行病学数据显示,2型糖尿病患者患卵巢癌的风险增加[6]。此外,患有糖尿病的卵巢癌患者已被证实具有较低的存活率。另有研究证实,代表卵巢癌发生发展的早期(良性),中期及晚期(攻击性与侵袭性)阶段的小鼠卵巢表面的上皮细胞显示越来越多的糖酵解表型。该表型证实了卵巢癌的发生发展与糖酵解途径存在相关关系[7-8]。基于葡萄糖在卵巢癌细胞生长中的作用仍然知之甚少,本研究旨在测试葡萄糖对卵巢癌细胞的细胞生长增殖的影响。

1材料与方法

1.1细胞系

人卵巢癌细胞系SKOV3与A2780均由山东大学附属山东省肿瘤医院基础实验室提供。

1.2主要试剂与仪器RPMI

1640、DMEM/F12培养基以及胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)均购自美国Gibco公司,四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyltetrazolium,MTT)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-Tetrameth-ylethylenediamine)购自美国Sigma公司,二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)购自中国碧云天公司,AnnexinⅤ/FITC细胞凋亡试剂盒购自美国BD公司。SpectraMaxi3型荧光酶标仪购自德国MolecularDevices公司,FACSCalibur型流式分析仪购自美国BD公司。

1.3方法

1.3.1实验分组

根据参考文献[9]及预实验,选定0、2.5、5.5和25.0mmol/L葡萄糖浓度进行分组,分别代表无糖、低血糖、正常血糖浓度及高血糖浓度的环境。

1.3.2人卵巢癌细胞的培养

A2780细胞与SK-OV3细胞分别选用含质量分数为10%FBS的RPMI1640与含质量分数为10%FBS的DMEM/F12培养基进行培养;培养基中加入质量分数为1%的抗生素。将细胞转至37℃、5%CO2的培养箱内进行培育。

1.3.3MTT法细胞增殖检测

分别选取生长状态良好的SKOV3和A2780细胞制成单细胞悬液,根据细胞特性不同,将每种细胞约4000个/孔接种在含有其相应培养基的96孔板中。24h后,将细胞在对应不同刺激条件的培养基中继续培养48h。加入5μL/孔MTT溶液(5mg/mL),继续培养1h后吸走孔内液体,向每孔加入100μLDMSO终止MTT反应。最终通过测定在570nm波长下吸光度值检测细胞活性。每个试验依据上述步骤至少重复3次。

1.3.4PI染色法检测细胞周期

使用碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色法评估各组葡萄糖对SK-OV3与A2780细胞周期的作用,由20μg/mLPI+200μg/mLRNaseA+0.1%TritonX-100配制。以1.0×106mL-1铺种到培养皿,过夜待细胞贴壁后,更换各组培养基。胰酶消化后使用冷PBS洗涤1~2次。室温下1200r/min离心5min(r=11.5cm),去除上层的液体,加入预冷的体积分数为70%乙醇5mL悬浮固定细胞,密封,4℃放置24~72h。固定后室温下1200r/min离心5min(r=11.5cm),去除上层液体。使用1mL预冷磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline,PBS)洗涤2遍后1200r/min离心5min(r=11.5cm)并去除上清,加入一定量的PI(200~400μL)染液。使用流式细胞分析仪评估处于各个周期阶段的细胞数。本试验依照上述步骤至少重复3次。

1.3.5细胞凋亡检测

使用AnnexinⅤFITC试剂盒检测AnnexinⅤ的表达。将细胞以1.0×106mL-1接种在培养皿中过夜培养,在上述糖浓度下培养24h。收集细胞后用PBS洗涤,将细胞置于避光条件下置于含有AnnexinⅤ与PI双染色溶液(0.1μgAnnexinⅤFITC+1μgPI)的100μLbinding悬浮15min,并最终通过流式细胞仪检测。本试验依照上述步骤至少重复3次。

1.4统计学方法

利用GraphpadPrism6.0对所有据进行统计的分析,计量资料以x-±s表示,组间比较采用t检验。当比较两组之间的均数差异时,使用t检验,当≥3个样本时,使用方差分析。检验水准α=0.05。

2结果

2.1高糖促进卵巢癌细胞的增殖

根据上述糖浓度培养卵巢癌细胞48h,通过MTT检测发现,随着葡萄糖浓度增加,细胞增殖的相对百分比升高。SKOV3细胞高糖组较无糖组细胞增殖约(1.942±0.086)倍,t=20.77,P=0.0002;与低糖组比较,细胞增殖幅度自(1.161±0.117)倍变为(1.942±0.086)倍,t=7.949,P=0.004;A2780细胞高糖组与无糖组相比,增殖约(1.841±0.157)倍,差异均有统计学意义(t=4.193,P=0.002),说明低糖条件抑制卵巢癌细胞生长,高糖条件促进卵巢癌细胞生长。

2.2低糖诱导卵巢癌细胞G1阻滞

使用不同葡萄糖浓度培养细胞24h之后,与高糖组相比,低糖组细胞处于G0/G1期的百分比相对增多,随着糖浓度减低,SKOV3细胞处于G0/G1的百分比依次为(40.699±1.131)%、(43.243±1.577)%、(44.846±1.768)%和(58.169±2.643)%,A2780细胞分别为(46.348±2.150)%、(50.875±8.598)%、(52.911±6.793)%和(54.770±2.475)%。SKOV3与A2780卵巢癌细胞高糖组(t=8.888,P=0.012)与无糖组(t=5.358,P=0.031)比较,差异均有统计学意义。2.3低糖诱导卵巢癌细胞的凋亡图3示,采用AnnexinⅤ/PI法评估细胞凋亡数目,将细胞在上述糖浓度中培养24h,高糖组、正常糖组、低糖组与无糖组中,SKOV3细胞发生凋亡的比例依次为(3.980±0.962)%、(6.618±0.632)%、(11.000±0.778)%和(14.015±0.827)%。低糖组与正常糖组相比差异有统计学意义,t=7.013,P=0.006;低糖组与高糖组比较,差异有统计学意义,t=8.027,P=0.015。A2780细胞中发生凋亡的细胞比例依次为(3.745±0.686)%、(4.490±0.198)%、(5.538±0.921)%和(12.930±1.127)%,无糖组与高糖组相比差异有统计学意义,t=8.984,P=0.012。

3讨论

正常细胞癌变时,其葡萄糖代谢将从氧化磷酸化状态转化为有氧糖酵解。肿瘤细胞通过新陈代谢提供其生长与分裂所需的生物合成,并且维持其自身于较低水平的氧化(还原)稳态。即使处于丰富的氧含量条件中,其能量产生优先依赖于糖酵解。虽然糖酵解途径中的三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)的净产率不及氧化磷酸化途径,但是肿瘤细胞通过提高葡萄糖摄取率这一特点,反过来促进更高速率的糖酵解效应进行[10]。因此,肿瘤细胞具有更高的能量消耗比率,其生长与合成对葡萄糖呈高度依赖性。本研究结果显示,给予不同葡萄糖浓度培养48h后,随着糖浓度增高,SKOV3与A2780卵巢癌细胞增殖为1.841~1.942倍,表明高葡萄糖浓度通过促进癌细胞产生ATP及其他生物前体的合成,为癌细胞生长提供足够的能量,从而快速促进卵巢癌细胞增殖。

在低糖与无糖条件刺激下,大多数肿瘤细胞通过诱导凋亡、应激以及细胞周期阻滞,最终导致细胞死亡[11-12]。为进一步探讨低糖与无糖条件对卵巢癌细胞周期的影响,本研究通过体外设立4组葡萄糖浓度,模拟人体不同生理状态的血糖水平[9],结果显示,通过对SKOV3与A2780卵巢癌细胞进行上述干预后,癌细胞发生G1期阻滞,阻碍了针对其细胞分裂所进行的生物合成,如RNA、蛋白质及其他生物前体,从而抑制细胞分裂、增殖。AnnexinⅤ作为一种磷脂结合蛋白,其通过磷脂酰丝氨酸与早期凋亡细胞的胞膜结合,故常作为检测早期凋亡细胞的灵敏指标。

本研究中,在低糖或无糖条件刺激下,卵巢癌细胞凋亡比例为5.538%~14.015%,高糖组细胞凋亡比例为3.745%~3.980%,表明葡萄糖减低时,可能通过阻断糖酵解导致ATP能量缺失而引发线粒体损伤,线粒体内、外膜之间的通透性转换孔开放,释放细胞凋亡启动因子,引发细胞凋亡。由此可以认为,低糖或无糖刺激抑制卵巢癌细胞增殖,可归因于诱导其细胞周期G1期阻滞并卵巢癌细胞凋亡。综上所述,本研究通过探讨葡萄糖对卵巢癌细胞生长与增殖的影响,证明低糖与无糖条件诱导细胞发生G1期阻滞、细胞凋亡并抑制其增殖。因此,若进一步给予相应抑制剂干预,有可能为卵巢癌的临床治疗提供新思路,这需要更深入的研究。

参考文献:

[12]谢泽君,唐玥,周静,等.二甲双胍联合2-脱氧-D-葡萄糖对肝癌细胞增殖与凋亡的影响及其机制[J].国际肿瘤学杂志,2017,44(2):81-84.

作者:尹雅洁1,2;盛修贵2,3;王兴武2,4;高楠1,2;王菲1,2;邓祥云1,2 单位:1.济南大学•山东省医学科学院.医学与生命科学学院,2.山东大学附属山东省肿瘤医院妇瘤科,3.中国医学科学院肿瘤医院深圳医院妇瘤科,4.山东大学附属山东省肿瘤医院基础实验室

葡萄糖对卵巢癌细胞生长增殖影响责任编辑:张雨    阅读:人次