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槲皮素对宫颈癌细胞增殖的影响

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【摘要】目的:探讨槲皮素对于人宫颈癌细胞SiHa的作用及机制。方法:用不同浓度的槲皮素(0、20、40和80μmol/L)处理SiHa细胞不同时间后(24h,48h和72h),通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力的变化;通过流式细胞仪检测槲皮素对细胞周期的影响;通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Westernblotting)检测槲皮素对细胞周期蛋白D1(CyclinD1)表达的影响。结果:MTT法检测结果显示,槲皮素处理SiHa细胞24h和48h后,40μmol/L和80μmol/L组的细胞活力低于对照组(P<0.05);槲皮素处理SiHa细胞72h后,20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L组的细胞活力低于对照组(P<0.05);在40μmol/L和80μmol/L组,随着培养时间延长,细胞活力较24h时降低(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,SiHa细胞经过20、40和80μmol/L浓度的槲皮素分别处理48h后,处于G0/G1期的细胞百分比明显高于对照组。RT-PCR和Westernblotting结果显示,槲皮素可以下调SiHa细胞中CyclinD1蛋白的表达。结论:槲皮素通过下调SiHa细胞中CyclinD1蛋白的表达,可以抑制SiHa细胞的活力和增殖。

【关键词】槲皮素;宫颈肿瘤;细胞周期蛋白D1;细胞增殖

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,在全球范围内,宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌,高居女性恶性肿瘤的第2位,而世界每年宫颈癌的新发病例为50多万人,因罹患宫颈癌而死亡的病人有20多万,是一种严重危害女性健康的恶性疾病[1]。槲皮素(quercetin,Que)广泛分布于植物的果实、叶子以及花中,是一种天然的多羟基黄酮类化合物,具有很高的药用价值,研究表明槲皮素具有多种药理活性,包括抗炎症、抗氧化、抗病毒、调节血脂、降血压及保护心肌缺血再灌注等作用。目前研究表明,槲皮素不仅可以抑制多种肿瘤细胞的增殖,还可以降低肿瘤细胞迁移和侵袭的能力,在多种恶性肿瘤具有抗肿瘤的生物学作用[2]。但是,槲皮素对人宫颈癌SiHa细胞增殖的影响目前还不清楚。因此,本研究通过使用槲皮素处理人宫颈癌SiHa细胞,研究槲皮素对人宫颈癌SiHa细胞的影响,并初步探讨槲皮素在SiHa细胞中的作用机制,从而为槲皮素的临床应用提供相关的实验基础。

1材料与方法

1.1材料

人宫颈癌SiHa细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。槲皮素购于美国Sigma公司,DMEM培养基购于美国Gibco公司,胎牛血清购于浙江天杭生物科技股份有限公司,细胞周期蛋白D1鼠单克隆抗体和β-actin鼠单克隆抗体均购于美国SantaCruz公司,二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司,噻唑蓝(MTT)试剂购于美国Sigma公司,RNA提取试剂Trizol购于美国Invitrogen公司,一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒、琼脂糖购于美国TaKaRa公司,其余为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1细胞培养

人宫颈癌SiHa细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于含5%CO2的37℃孵箱中进行常规培养,每3~4d用胰酶消化,传代1次。

1.2.2槲皮素的配置与实验分组

将槲皮素溶解于DMSO中配置成储存母液,于-20℃冰箱保存。在进行实验时,用DMEM培养基分别进行稀释,DMSO的最终浓度<0.1%。对数生长期的人宫颈癌SiHa细胞分为对照组(DMEM培养基+DMSO,槲皮素浓度为0μmol/L)和实验组(槲皮素浓度分别为20、40和80μmol/L)。

1.2.3MTT法检测细胞活力

将处于对数生长期的人宫颈癌SiHa细胞通过胰酶消化后,制成单细胞悬液,以3×104的细胞浓度接种于96孔细胞培养板中,每孔加入200μL的DMEM培养基。次日,待细胞贴壁后,更换为含有不同浓度槲皮素的DMEM培养基进行培养(槲皮素浓度分别为0、20、40和80μmol/L),分别培养24、48、72h后,吸弃各孔内的培养基,分别加入100μL的MTT(5g/L),37℃孵育4h后吸弃各孔中的上清液,分别加入150μLDMSO,于摇床震荡10min后,用酶标仪测定490nm波长处每孔的光密度值(OD),每组均设置3个复孔。细胞活力的计算公式:细胞活力(%)=(槲皮素组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.4流式细胞仪检测细胞周期

将处于对数生长期的人宫颈癌SiHa细胞通过胰酶消化后,接种于6孔细胞培养板中,次日待细胞贴壁后,更换为含有不同浓度槲皮素的DMEM培养基(槲皮素浓度分别为0、20、40和80μmol/L),继续培养48h后,通过胰酶常规消化并收集各组细胞,1000r/min离心5min后,吸弃上清液,用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次后,加入预冷的70%的乙醇,于4℃冰箱固定细胞12h,之后1000r/min离心5min,PBS洗涤细胞2次,用含0.01%核糖核酸酶(RNase)的碘化丙啶(PI)染液处理细胞后,避光染色30min后,使用流式细胞仪进行检测,通过CellQuest软件分析结果,每组均设置3个复孔。

1.2.5RT-PCR将处于对数生长期的人宫颈癌

SiHa细胞通过胰酶消化后,接种于6孔细胞培养板中,次日待细胞贴壁后,更换为含有不同浓度槲皮素的DMEM培养基(槲皮素浓度分别为0、20、40和80μmol/L),继续培养48h后收集各组细胞,按照RNA提取试剂盒提取总RNA,以CyclinD1引物进行RT-PCR检测,上游5′-GAACACCAGCTCCTGTGCT-GCG-3′;下游5′-TGTCCACGTCCCGCACGTT-3′;扩增产物大小为880bp。

1.2.6蛋白质印迹法(Westernblotting)

将处于对数生长期的人宫颈癌SiHa细胞通过胰酶消化后,接种于6孔细胞培养板中,次日待细胞贴壁后,更换为含有不同浓度槲皮素的DMEM培养基(槲皮素浓度分别为0、20、40和80μmol/L),继续培养48h后收集各组细胞,分别加入细胞裂解液收集细胞蛋白,并测定各组细胞的蛋白浓度。将蛋白样本与蛋白质分子质量标准分别上样于加样孔,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白。电泳结束后,进行转膜,转膜结束后,将膜移至含5%的脱脂奶粉的Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(TBST)中室温封闭1h,用TBST洗膜10min×4次。加入一抗,4℃孵育过夜。次日,TBST洗膜10min×4次,加辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1h,TBST洗膜10min×4次,然后用化学发光检测液进行发光反应,于暗室中曝光。

1.3统计学方法

采用SPSS12.0软件进行统计学分析。定量资料用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用析因设计的方差分析和单因素方差分析,2组样本间的均数比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1槲皮素对人宫颈癌细胞SiHa的细胞活力影响

MTT法检测结果显示,槲皮素处理SiHa细胞24h和48h后,40μmol/L和80μmol/L组的细胞活力低于对照组,槲皮素处理SiHa细胞72h后,20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L组的细胞活力低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);在40μmol/L和80μmol/L组,随着培养时间延长,细胞活力较24h时降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2槲皮素对SiHa细胞细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果显示,SiHa细胞经过20、40和80μmol/L浓度的槲皮素分别处理48h后,处于G0/G1期细胞的百分比分别为(58.46±1.58)%、(64.92±1.15)%和(71.50±1.18)%,与对照组(52.24±1.46)%相比均升高,差异有统计学意义(P<0.05),见图1。此外,SiHa细胞经过20、40和80μmol/L浓度的槲皮素分别处理48h后,处于S期细胞的百分比分别为(35.48±0.91)%、(26.53±1.93)%和(21.96±0.33)%,与对照组(41.63±2.11)%相比均减少,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3槲皮素对SiHa细胞中CyclinD1蛋白表达的影响

RT-PCR和Westernblotting结果显示,在使用不同浓度的槲皮素处理SiHa细胞48h后(槲皮素浓度分别为20、40和80μmol/L),SiHa细胞中CyclinD1在转录水平以及蛋白水平的表达均出现了不同程度的下调,差异有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

槲皮素是一种广泛分布于植物的果实、叶子以及花中的多羟基黄酮类化合物,目前在100多种中草药中均可以检测到槲皮素的存在,其主要的生物学功能包括抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎症以及保护心血管等。研究表明,槲皮素对于多种恶性肿瘤细胞具有抑制作用[3]。在乳腺癌中,槲皮素发挥雌激素样的作用,可以抑制乳腺癌细胞的增殖[4-5]。在肝癌细胞中,槲皮素可以通过诱导细胞凋亡而抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖[6-8]。而在结肠癌中,槲皮素可以通过上调p21和p27蛋白的表达,使人结肠腺癌细胞RKO的细胞周期阻滞于G0/G1期,从而抑制人结肠腺癌细胞RKO的增殖[9]。同样的,在卵巢癌细胞中,槲皮素也可以阻止细胞周期从G0/G1期向S期的转换,从而抑制卵巢癌细胞的增殖[10]。本研究MTT的结果显示,在槲皮素处理时间相同的条件下,随着槲皮素浓度的增加,槲皮素对于SiHa细胞活力的抑制作用逐渐增强。

同样的,在槲皮素浓度相同的条件下,随着作用时间的增加,槲皮素对于SiHa细胞活力的抑制作用也逐渐增强。因此,槲皮素可以抑制SiHa细胞的细胞活力和细胞增殖。此外,通过流式细胞仪分析槲皮素处理后SiHa细胞中细胞周期的变化,发现SiHa细胞经过20、40和80μmol/L浓度的槲皮素分别处理48h后,处于G0/G1期的细胞百分比与对照组相比均出现了增加,差异有统计学意义(P<0.05);而SiHa细胞经过20、40和80μmol/L浓度的槲皮素分别处理48h后,处于S期的细胞百分比与对照组相比均出现了减少,差异有统计学意义(P<0.05)。可见,槲皮素可以阻滞细胞周期从G0/G1向S期的转换,增加G0/G1期的细胞数量,同时减少S期的细胞数量,这些结果与槲皮素在结肠癌[10]以及卵巢癌[11]中所观察到的可以阻滞肿瘤细胞从G0/G1期向S期转换的结果是一致的。

此外,通过检测周期相关蛋白CyclinD1的表达发现,槲皮素可以下调SiHa细胞中CyclinD1蛋白的表达,随着浓度的增加,槲皮素对CyclinD1表达抑制的作用出现了进一步的加强。因此,结合MTT以及细胞周期的结果,推测槲皮素可以通过下调SiHa细胞中CyclinD1蛋白的表达,从而阻滞肿瘤细胞从G0/G1期向S期的转换,抑制SiHa细胞的增殖和活力。综上所述,槲皮素可以抑制SiHa细胞的增殖和活力,而这种抑制作用可能是通过调节周期相关蛋白CyclinD1的表达来实现的,但是槲皮素具体通过何种途径实现其对CyclinD1表达的调控还有待进一步的研究。

参考文献:

[2]赵蕾,赵雪梅,马朋,等.槲皮素抗肿瘤作用的研究新进展[J].现代中药研究与实践,2013,27(3):78-81.

[3]孙涓,余世春.槲皮素的研究进展[J].现代中药研究与实践,2011,25(3):85-88.

[4]柯昌虎,朱雪松,朱军,等.槲皮素抗乳腺癌作用机制的研究进展[J].中国医院药学杂志,2016,36(16):1420-1425.

[6]史桂兰,黄琳,卿海燕,等.槲皮素对人肝癌SMMC-7721细胞生长抑制及诱导凋亡作用[J].中国实验诊断学,2015,19(1):17-19.

[7]陈兆勋,高彦宇,李冀.不同浓度槲皮素对人肝癌细胞株Hep3B、Huh7细胞凋亡的影响[J].中医杂志,2015,56(12):1051-1053.

[9]邱雪梅,马超英.槲皮素抗结肠癌的研究进展[J].中华中医药学刊,2015,33(10):2333-2335.

[10]邓晓慧,宋海岩,孙春莉.槲皮素对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖的影响[J].中国病理生理杂志,2013,29(1):99-102.

作者:张欣;董春力;付丽丽;杜鹃;李少闻

槲皮素对宫颈癌细胞增殖的影响责任编辑:张雨    阅读:人次