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地西他滨诱导宫颈癌细胞凋亡分子机制研究

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【摘要】目的地西他滨具有较好的抗肿瘤活性,其分子机制与DNA去甲基化有关,本研究通过DAC对腺瘤性结肠息肉病基因的表达水平和去甲基化的影响,探讨DAC诱导宫颈腺癌Hela细胞凋亡分子机制。方法不同浓度的DAC作用于宫颈腺癌Hela细胞24、36和48h,MTT法检测对宫颈癌细胞的增殖抑制作用,观察DAC对Hela细胞增殖的浓度依赖效应和时间依赖效应。流式细胞术检测DAC对宫颈腺癌Hela细胞凋亡和细胞周期的影响。在DAC作用于宫颈腺癌Hela细胞前后,通过甲基化特异性PCR检测APC基因的甲基化状态;RT-PCR法检测APC基因mRNA表达水平;蛋白质印迹法检测APC蛋白、β-catenin蛋白在胞内及核内表达的变化。结果DAC对宫颈腺癌Hela细胞增殖抑制具有浓度依赖效应和时间依赖效应,Hela细胞半数抑制浓度(IC50)24、36、48h分别为28.23、7.65和5.64μmol/L。DAC处理后的宫颈腺癌Hela细胞的凋亡率为(73.82±0.11)%,明显高于对照组的(12.41±0.24)%,P<0.001。DAC处理Hela细胞后,S期细胞比例(47.82±2.57)%和G2期细胞比例(30.87±2.28)%显著高于空白对照组的S期细胞比例(24.08±0.71)%和G2期细胞比例(2.52±0.84)%,P<0.001。DAC处理后,APC基因启动子区域去甲基化状态明显增高,APCmRNA表达量上升,处理前后比较差异有统计学意义,P<0.05。DAC处理后,胞内APC蛋白表达上调,而胞内和核内的β-catenin蛋白表达下调,差异均有统计学意义,P<0.05。结论DAC可通过对APC基因的去甲基化作用,上调胞内APC蛋白表达,下调胞内和核内β-catenin表达,诱导宫颈癌细胞凋亡。

【关键词】地西他滨;Hela细胞;甲基化;凋亡;宫颈癌

宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均较高。我国宫颈癌的发病率近年来呈年轻化的趋势,严重威胁着女性健康[1]。DNA甲基化是表观遗传学改变的主要分子机制之一,目前正受到科学家们的高度重视和关注[2-3]。腺瘤性结肠息肉病基因甲基化水平上调导致的基因功能下调是宫颈腺癌发生的早期事件,具有早期诊断的敏感性和特异性,在肿瘤发生、发展的全过程中稳定存在[4],通过抑制DNA甲基转移酶活性,能够阻断异常APC基因的异常甲基化,导致APC蛋白活性恢复。地西他滨(decitabine,DAC)是目前临床上常用抗癌药物,也是常见的DNA甲基化转移酶抑制剂之一[5]。临床上,DAC对急性髓性白血病和慢性髓性白血病等均有明显疗效。DAC用于宫颈癌的治疗目前鲜见报道,本研究从分子水平探讨DAC对宫颈癌的作用机制,为今后临床应用治疗宫颈腺癌提供新的思路和实验室依据,也可为宫颈腺癌的分子靶向治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1主要试剂

DAC购自美国Sigma公司,细胞凋亡检测试剂盒购自北京四正柏生物公司,鼠抗人APC单克隆抗体购自美国RD公司,PCR试剂盒购自上海生工公司。

1.2细胞培养宫颈腺癌

Hela细胞,用含10%FBS的1640培养基培养,置于温度37℃、5%CO2、相对湿度为90%的恒温培养箱中,进行培养。

1.3MTT检测

用0.25%的胰酶消化并收集生长状态良好的宫颈腺癌Hela细胞(保证细胞处于单细胞悬浮状态),将细胞调整到约104个/孔的密度铺种于96孔板,每孔体积约200μL,37℃、5%CO2培养箱内培养过夜;待细胞密度生长至80%以上时(一般培养过夜后),加处理因素。设空白对照组和DAC处理组,处理组药物浓度设为0.1、1、10和20μmol/L4个浓度,每组设4个复孔。在培养24、36、48h时加入MTT液20μL/孔,继续培养4h后,将上清液轻轻吸净,再加入DMSO200μL/孔,予振荡摇匀10min,待结晶溶解后。酶标仪设定检测A为570nm,测出各孔的吸光度,计算抑制率,并绘制出不同细胞系的生长曲线。

1.4流式细胞术检测细胞周期及凋亡

将人宫颈腺癌Hela细胞调整为2×105mL-1,接种在6孔无菌培养板中,每个孔共4mL,Hela细胞DAC的最终浓度为10μmol/L,每组均设复孔3个,设不加药对照孔。置于37℃、5%CO2饱和湿度条件的培养箱内,培养36h后,收集细胞以进行染色,流式细胞仪测定。

1.5MSP检测APC基因甲基化状况

首先按试剂说明书提取DNA,置于-20℃保存。紫外分光光度计检测DNA浓度。DNA浓度计算为A260×200×50μg/mL。鉴定DNA纯度可通过计算A260/A280比值。MSP检测主要步骤如下:(1)DNA亚硫酸盐修饰:充分振荡进行混匀后,室温下孵育约5~10min。

(2)重悬DNA:4℃,1000r/min,离心1min(r=15cm),弃上清,离心管底部可见一小块白色沉淀物即为DNA,加1mL的70%乙醇之后振荡,4℃,500r/min,离心1min(r=15cm),弃上清。每个样本中均加入30μL的TE缓冲液溶解,快速强力振荡,直到沉淀完全重悬,置于50~60℃水浴15min,以使DNA完全溶解,高速离心2~3min后,用吸管吸取上清液到一个新的微量离心管中,继续进行MSP检测或储存于-20℃(可保存≥2个月)或-80℃(可保存6个月以上)备用。

(3)设计APC甲基化和非甲基化引物,一组是甲基化引物(M),一组是非甲基化引物(U),引物序列APC-M上游引物为5′-GGTATATT-TTCGAGGGGTACG-3′,下游引物为5′-TTCCCGA-CCCGCACTCCGC-3′,退火温度56℃,扩增片段为90bp;APC-U上游引物为5′-TGTGAGGGTATAT-TTTTGAGGGGTAT-3′,下游引物为5′-CTTCTCT-CTCCACTTCCCAACCCA-3′,退火温度56℃,扩增片段为109bp。

(4)MSP反应:PCR反应液:在冰浴条件下配制反应体系25μL,将下列各成分加入到0.2mL的无菌EP管中:10×TaqBuffer2.5μL,TaqHotstart0.15μL,dNTP2.0μL,上引物1μL,下引物1μL,DNA3μL,TaqDNA聚合酶(1U/μL)1μL,H2O补足25μL。PCR反应条件:95℃5min,95℃45s,56℃45s,72℃45s,40个循环;72℃延伸7min,10℃结束反应,各PCR产物-20℃冰箱保存。

(5)电泳及结果判断:8μL的PCR产物中,加入1.5μL的电泳上样缓冲液,进行充分地混匀,加样于2.5%的琼脂糖凝胶上,进行电泳,设定电压为88V,电泳40min后,通过凝胶图像分析系统进行观察并保存结果。

(6)阳性的结果判断:扩增后,如果甲基化产物中有目的条带,而非甲基化产物中没有目的条带,则说明APC发生了甲基化,如果在非甲基化产物中出现目的条带,而在甲基化产物中不出现目的条带;则说明基因未发生甲基化,如果APC-甲基化引物和APC-非甲基化引物扩增时,同时出现了扩增条带,则说明APC发生了不完全甲基化。

1.6RT-PCR检测

APC上游引物为5′-GTCCCTCCGTTCTTATG-GAA-3′,下游引物为5′-GGCTATTCTTCGCTGTG-CTC-3′,扩增片段385bp。β-actin上游引物为5′-G-GACCTGACTGACTACCTC-3′,下游引物为5′-CA-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′,扩增片段553bp。cDNA逆转录按说明书上步骤进行操作:按20μL体积进行配制,在冰上操作,反应体系如下:5×ReveresBuffer4μL,10mmoldNTP2μL,RNA酶抑制剂0.5μL,AMV逆转录酶0.5μL,Oligo(dT)18引物1μL,TotalRNA2μg,加入无RNA酶水,定容至20μL,55℃30min,85℃5min,冰上终止反应。PCR扩增,体系如下:2×TaqMasterMix10μL,上游引物10μmol/L1μL,下游引物10μmol/L1μL,cD-NA2μL,Rnase-FreeWater定容至25μL。PCR仪上65℃孵育5min,然后置冰上冷却。PCR反应条件:预变性94℃5min,变性94℃30s,53℃30s,55℃40s,72℃30s,72℃7min,4℃冷却,35个循环。取5μLPCR产物进行凝胶电泳,以DL-Mark2000作为指示,恒压100V电泳30min左右。凝胶成像后分析灰度值,计算目的基因的表达量。

1.7蛋白质印迹法检测

(1)分别收集DAC处理36h的Hela细胞5×106个细胞,按提取试剂盒步骤分别提取总蛋白与核蛋白。立即使用,或-70℃冻存。BCA蛋白浓度测定法分别取总蛋白和核蛋白测定浓度。

(2)蛋白质变性:加SDS上样并缓冲液混匀,沸水煮5min后,冰上放置2min,-80°C保存备用。

(3)SDS-PAGE电泳:80V电泳约30min,再100V电泳溴酚蓝跑到底时终止电泳,进行转膜。

(4)转膜:湿转法,100V恒压90min。

(5)封闭、孵育抗体:5%脱脂奶粉封闭之后,予5%BSA稀释一抗,4℃,摇床过夜。用5%脱脂奶粉稀释二抗,室温脱色摇床上摇动1.5h。

(5)化学发光、显影、定影及分析,灰度扫描。

1.8统计学方法实验所得数据采用SPSS18.0分析,以x-±s表示,两两比较采用χ2检验,多组之间采用非参数K检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1对宫颈腺癌Hela细胞生长抑制作用

MTT法检测结果显示,当DAC处理后,不同时间点上,细胞的抑制率随着DAC浓度的增加(0.1、1、10和20μmol/L)呈上升趋势,高浓度(20μmol/L)对细胞的增殖抑制最明显。说明DAC对宫颈腺癌Hela细胞的生长抑制有浓度依赖效应。不同时间点DAC处理后各组之间的Hela细胞抑制率比较差异有统计学意,P<0.001。DAC对宫颈腺癌Hela细胞的生长抑制有时间依赖效应。细胞半数抑制浓度(IC50)24、36、48h分别为28.23、7.65和5.64μmol/L。根据不同浓度不同时间所得的IC50值,在后续实验中选择最佳浓度为10μmol/L,最佳处理时间36h。

2.2对宫颈腺癌Hela细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果如图2显示,DAC处理后宫颈腺癌Hela细胞的凋亡率为(73.82±0.11)%,明显高于对照组的(12.41±0.24)%,两者比较差异有统计学意,P<0.001。

2.3对宫颈腺癌Hela细胞细胞周期的影响

DAC处理Hela细胞后,S期细胞比例(47.82±2.57)%和G2期细胞比例(30.87±2.28)%明显高于空白对照组的S期细胞比例(24.08±0.71)%和G2期细胞比例(2.52±0.84)%,处理前后比较,S期和G2期细胞比例差异均有统计学意义,P<0.001;表明DAC主要阻滞宫颈腺癌Hela细胞于S期和G2期。

2.4对APC基因甲基化的影响

MSP法检测DAC处理前后Hela细胞的甲基化状态,发现Hela细胞株中存在APC基因启动子区的高甲基化,经过DAC处理之后出现较明显非甲基化条带,表现部分甲基化状态,甲基化扩增产物出现减少,非甲基化扩增产物增多(图3)。表明DAC可以明显逆转Hela细胞株APC基因甲基化状态。

2.5对APCmRNA表达影响

无DAC干预的情况下,APC基因的表达量低;DAC处理后APC基因mRNA的表达水平明显升高,处理前APCmRNA的相对表达量为0.823±0.21,处理后相对表达量为0.279±0.17,两样本比较差异有统计学意义,P<0.001(图4)。表明DAC可促进APCmRNA的表达。注:Marker.DNA标记;U.非甲基化引物扩增后DNA条带;M.甲基化引物扩增后DNA条带图3地西他滨处理前后Hela细胞中APC基因的甲基化状态图4RT-PCR检测地西他滨对宫颈癌Hela细胞APCmRNA表达的影响

2.6APC蛋白和β-catenin蛋白的表达

DAC处理组APC蛋白相对表达量为1.542±0.053,未处理组胞内相对表达量为0.780±0.021;未处理组胞内β-catenin蛋白相对表达量为0.890±0.032,DAC处理组相对表达量为0.354±0.015;DAC处理组中APC蛋白表达水平增加,β-catenin蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义,P<0.001(图5)。说明DAC促进胞内APC蛋白表达,抑制β-catenin蛋白表达。由于APC蛋白在核内不表达,所以仅检测核蛋白中β-catenin蛋白在DAC干预前后的表达情况,结果显示,空白对照组核内β-catenin蛋白相对表达量为0.632±0.036,高于实验组相对表达量的0.336±0.013,差异均有统计学意义,P<0.001。说明DAC抑制核内β-catenin蛋白表达。

3讨论

宫颈癌的发生发展与表观遗传学异常有很大的联系,人们普遍认为引起宫颈癌的一个重要原因是肿瘤相关基因启动子区域CpG岛的高甲基化[5]。有研究发现,DNA启动子发生甲基化后,可影响基因转录过程中的模板DNA链与RNA聚合酶的结合,降低基因的转录活性,抑制抑癌基因的表达,引起肿瘤细胞的异常增殖,与恶性肿瘤的发生发展密切相关[6]。DNA甲基化是许多抑癌基因功能失活的机制之一,且在某些情况下,甚至是许多抑癌基因功能失活的唯一方式,越来越多的研究发现,DNA甲基化参与了癌症启动过程和进展[2-3]。由于DNA甲基化具有可逆性的特点,表达沉默的抑癌基因、DNA损伤修复基因、细胞周期调控基因以及信号通路中的某些关键调控因子等出现异常甲基化后,可以在DNA甲基化抑制剂的作用下逆转而发生去甲基化,可恢复抑癌基因的活性从而抑制肿瘤的生长,这对于抗肿瘤治疗来说是十分有意义的。

APC基因是在Wnt/β-catenin信号转导通路中的重要抑癌基因,研究发现,APC基因启动子的高甲基化及基因转录缺失见于多种肿瘤,也是与宫颈腺癌发生密切相关的抑癌基因[7-9]。APC基因甲基化水平的上调导致的基因功能下调是宫颈腺癌发生的早期事件,具有早期诊断的敏感性和特异性,在肿瘤发生、发展的全过程中稳定存在[10],APC蛋白与β-catenin结合时,能够促进β-catenin的丝氨酸和苏氨酸残基发生磷酸化,继而β-catenin在蛋白酶体中发生降解。若APC蛋白出现缺失,则无法与β-catenin蛋白结合,胞质中积累的β-catenin通过转位进入到细胞核中,与Tcf-4结合形成复合体,启动增殖相关基因(如c-myc,CyclinD1)的转录,导致肿瘤细胞的生长失控[11]。有研究发现,APC甲基化水平与宫颈癌发生发展相关,宫颈癌组APC基因甲基化率56.8%明显高于正常对照组的10%;APC甲基化阳性率随肿块增大及淋巴结转移而增高;且与不同宫颈癌病理类型相关[12]。DAC是目前临床上常用抗癌药物,也是常见的DNA甲基化转移酶抑制剂之一,属于脱氧胞苷酸的腺苷类似物。DAC使已经发生高度甲基化的基因发生去甲基化改变,并激活沉默失活的基因,使得抑癌基因功能活化,促凋亡分子表达水平的增高,从而抑制肿瘤细胞生长[13]。

DAC能够逆转多种实体瘤的恶性生物学行为,但目前并不清楚它对宫颈腺癌细胞是否也有类似的作用。本研究发现,DAC对宫颈腺癌Hela细胞的生长抑制有时间依赖和浓度依赖效应;DAC能显著诱导宫颈腺癌Hela细胞凋亡,且主要阻滞在细胞周期的S期和G2期,表明DAC促进宫颈腺癌Hela细胞凋亡是由于能影响细胞的分裂和DNA后期的合成。DAC诱导APC去甲基化主要是通过该基因5’端启动子区CpG岛去甲基化而实现,在本研究中,未经DAC处理的宫颈腺癌Hela细胞,其APC基因出现高甲基化。而使用去甲基化药物DAC处理后,Hela细胞的APC基因出现了较明显的去甲基化,这表明DAC对Hela细胞中的APC基因有去甲基化作用。进一步采用RT-PCR方法检测APCmRNA的表达,结果显示,DAC处理后甲基化水平下调,而APCmRNA的表达量明显增加,说明了在DAC能够使APC基因5’端启动子区CpG岛发生去甲基化,恢复APC基因的活性,导致APC基因的mRNA和蛋白表达均上调。DAC可通过对APC基因的去甲基化作用,诱导宫颈腺癌Hela细胞凋亡。DAC处理后APC蛋白明显增加,β-catenin蛋白明显减少,有助于抑制肿瘤生长。APC蛋白与β-catenin蛋白均为Wnt/β-catenin信号转导通路中重要的物质,此结果说明DAC作用于宫颈腺癌Hela细胞后,Wnt/β-catenin信号转导通路产物量减少,促进细胞凋亡,抑制肿瘤生长。说明DAC可通过下调胞内和核内β-catenin表达抑制Wnt/β-catenin信号通路,诱导宫颈腺癌Hela细胞凋亡。总之,DAC诱导APC基因去甲基化可能是通过抑制WNT信号通路并促进宫颈癌细胞凋亡,从而达到治疗肿瘤的目的,为特异性甲基化酶抑制剂应用于临床治疗提供了有用理论依据和实验基础。

参考文献

[1]李雪,孔为民,韩超,等.首都医科大学附属北京妇产医院1992-2011年间宫颈癌发病趋势分析[J].中华妇幼临床医学杂志,2013,9(3):310-314.

[4]王宏,潘世扬,庞智睿,等.子宫颈癌和CIN患者血浆APC和RASSF1A基因启动子甲基化检测的意义[J].中华妇产科杂志,2013,48(12):929-934.

[12]陈勇,陈双郧,张春莲,等.宫颈癌APC基因启动子甲基化与其临床病理特征的关系[J].中国癌症杂志,2009,19(10):755-760.

作者:宋汶珂;唐彩霞;黄彤辉;孙晓红 单位:南华大学附属南华医院妇产科

地西他滨诱导宫颈癌细胞凋亡分子机制研究责任编辑:张雨    阅读:人次