香芹酚处理癌细胞论文范文

1材料与方法

1．1流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期BGC-823细胞以5×105•ml－1接种于6孔板中，分为对照组、香芹酚处理组，每组设3个复孔，加药48h后，收集各组细胞，PBS洗2次，离心弃上清，悬于结合缓冲液中，调整细胞浓度为1×106•ml－1。加5μlAnnexinV-FITC和PI混匀液，避光室温孵育10min。用结合缓冲液洗1次后用流式细胞仪进行检测分析。AnnexinV(－)PI(－)为活细胞，AnnexinV(－)PI(+)为机械损伤细胞，AnnexinV(+)PI(－)为早期凋亡细胞，AnnexinV(+)PI(+)为晚期凋亡细胞，实验中以AnnexinV(+)作为凋亡细胞［8］。

1．2Transwell检测细胞侵袭能力Matrigel基质胶包被Transwell上室内膜。无血清细胞培养液调整BGC-823细胞密度，按5×103•ml－1的密度接种上室，同时加入终浓度为80μmol•L－1的香芹酚，下室加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于细胞培养箱中培养。于48h后取出上室，4%甲醛固定15min，晾干后结晶紫染液染色5min，倒置显微镜下观察拍照。33%冰醋酸洗净结晶紫，收集洗脱液酶标仪检测(A573nm)［9］。

1．3QuantitativeRealtime-PCR检测MMP-9、TIMP-1mRNA的表达80μmol•L－1香芹酚处理48h的BGC-823细胞作为实验组;未处理的BGC-823细胞作为对照组。按Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，电泳鉴定并定量后，依据Takara公司逆转录说明书将提取的RNA逆转录成cDNA，实时荧光定量PCR反应:SYBR反应体系共25μl，反应条件:95℃2min，95℃10s，60℃30s，40个循环，溶解曲线95℃2min，95℃15s，60℃1min，95℃15s。以2-ΔΔCt表示计算目的基因mRNA的相对表达量，每组重复3次取平均值。所检测的目的基因和内参基因的相关引物设计合成由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列见表1。

1．4Westernblot检测相关蛋白的表达收集细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量。取各组总蛋白40μg进行SDS-PAGE，转膜，5%脱脂奶粉封闭1h，一抗4℃孵育过夜。加入1∶5000倍稀释二抗，37℃孵育1h，ECL法进行底物发光，曝光成像后扫膜分析。

1．5统计学分析采用SPSS18．0统计软件进行统计分析，计量数据以x珋±s表示，组间比较采用t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1香芹酚对胃癌BGC-823细胞的增殖抑制效应MTT检测结果显示，不同浓度香芹酚处理细胞24h、48h、72h后，能够显著抑制胃癌BGC-823细胞的生长，香芹酚处理组与阴性对照组相比，差异均具有统计学意义(P＜0．05)，并且抑制效应呈浓度、时间依赖性，结果如图1所示。根据香芹酚对胃癌BGC-823细胞的生长抑制率计算出其作用48h的IC50分别为78．6μmol•L－1。

2．2香芹酚对胃癌BGC-823细胞凋亡的影响香芹酚处理胃癌BGC-823细胞48h后，使用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测，结果如图2所示，随着药物浓度的增加，细胞凋亡率也相应增加，呈剂量效应关系，差异均有统计学意义(细胞凋亡率:0μmol•L－1vs10μmol•L－1，0μmol•L－1vs20μmol•L－1，0μmol•L－1vs40μmol•L－1，0μmol•L－1vs80μmol•L－1;P均＜0．0001)，结果表明香芹酚能够有效诱导胃癌细胞的凋亡。

2．3香芹酚对胃癌BGC-823细胞侵袭的影响80μmol•L－1香芹酚处理胃癌BGC-823细胞48h后，使用Matrigel-transwell法检测细胞侵袭能力，结果如图3所示。同对照组相比，香芹酚处理组胃癌BGC-823细胞侵袭能力明显降低(0μmol•L－1vs80μmol•L－1，P＜0．0001)，结果表明香芹酚能够降低胃癌细胞细胞的侵袭能力。

2．4香芹酚对胃癌BGC-823细胞PARP、Caspase-9表达的影响香芹酚处理胃癌BGC-823细胞48h后，使用Westernblot检测香芹酚对细胞PARP、caspase-9表达的影响，结果如图4所示。同对照组相比，香芹酚处理组胃癌BGC-823细胞出现PARP裂解片段且caspase-9的表达明显升高，差异均有统计学意义(P＜0．0001)。

2．5香芹酚对胃癌BGC-823细胞MMP-9、TIMP-1表达的影响香芹酚处理胃癌BGC-823细胞48h后，使用实时荧光定量PCR检测香芹酚对细胞MMP-9、TIMP-1mRNA表达的影响，结果如图5所示，香芹酚处理组细胞MMP-9的表达明显降低，而TIMP-1的表达明显升高，差异均有统计学意义(P＜0．0001)。

2．6香芹酚对胃癌BGC-823细胞MAPK信号通路的影响香芹酚处理胃癌BGC-823细胞48h后，使用Westernblot检测香芹酚对细胞ERK、P38的激活情况，结果如图6所示，各组总ERK以及总P38的表达均无明显变化(P＞0．05)，香芹酚作用后磷酸化ERK表达有所降低，而磷酸化P38的表达有所升高，差异均有统计学意义(P＜0．0001或0．01)，结果表明香芹酚抑制了ERK的激活同时促进了P38的激活。

3讨论

香芹酚化学名称5-异丙基-2-甲基苯酚，又名异麝香草酚，是牛至油以及百里香油的主要成分，为一种安全的食品添加剂，常应用于糖果、饮料和口香糖的生产中［9］。研究表明，香芹酚有着广泛的生物活性，如抗炎、抗氧化以及抗肿瘤等效应。Aru-nasree［6］研究发现香芹酚作用于转移性乳腺癌细胞株MDA-MB231后，乳腺癌细胞的增殖能力明显降低，且凋亡明显增加，推测其可能通过增加线粒体释放细胞色素C以及激活caspase等所致。Koparal等研究表明香芹酚作用于非小细胞肺癌细胞株A549后，细胞增殖能力呈剂量依赖性的降低，同时DNA断裂，出现细胞凋亡，表明香芹酚对肺癌具有细胞毒性作用。Yin等将不同浓度的香芹酚作用于肝癌细胞株HepG2，结果显示肝癌细胞增殖受到抑制且凋亡细胞明显增加。本研究利用香芹酚处理胃癌细胞，结果显示胃癌BGC-823细胞增殖活性明显受到抑制，凋亡明显增加且侵袭能力降低，表明香芹酚具有一定的抗胃癌作用。

细胞内的一系列凋亡级联反应中均有caspase的参与，其中caspase-9为凋亡级联反应下游重要的效应酶。PRAP在维持DNA完整性上发挥着重要作用并被作为细胞凋亡的标志。若PRAP发生降解则失去对DNA完整性的保护作用，使核酸内切酶活性增高，裂解核小体间的DNA，从而引发细胞凋亡。本研究中香芹酚作用后胃癌细胞中PRAP出现了裂解的片段，且caspase-9表达升高，结果表明香芹酚能够有效诱导肿瘤细胞的凋亡活性。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信号通路主要包括ERK、P38以及JNK三条通路，其在细胞增殖、凋亡以及分化过程中发挥重要作用。研究表明，肿瘤组织中ERK通路常处于异常的激活状态，P38信号则参与多种细胞凋亡途径，P38的激活能够诱导c-Myc、p53以及Fas/FasL等多种凋亡相关蛋白的表达，从而诱导凋亡。ERK通路的激活能够抑制细胞的凋亡，而抑制ERK信号通路能够诱导细胞凋亡。近期研究显示香芹酚作用于肝癌细胞后，磷酸化ERK的表达显著降低，而磷酸化P38显著升高，但JNK未发生明显变化，本研究将香芹酚作用胃癌细胞后同样检测到ERK活性的降低，P38活性的升高，表明香芹酚诱导胃癌细胞凋亡的过程可能与ERK及P38信号通路相关。

胃癌易发生转移且目前尚无有效的治疗手段。肿瘤细胞侵袭转移为一个多步骤的生物学过程，其中细胞外基质和基底膜的降解是肿瘤的转移的重要环节，其中基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂(TIMPs)在此过程中发挥着关键作用［19］。香芹酚处理组组细胞侵袭能力显著降低同时MMP-9表达受到抑制而TIMP-1表达升高，提示香芹酚在抑制胃癌细胞侵袭的过程中也发挥着一定的作用。ERK信号转导通路参与MMPs表达的调节，抑制ERK的激活能够阻碍肿瘤的侵袭［20］，由此推测香芹酚抑制胃癌侵袭的作用可能与ERK通路的抑制有关，但此过程是否还有其他通路的参与及其详细的作用机制还有待于进一步研究。

作者：孙时华姜荣华祝海燕姜建军单位：江山市中医院浙江省衢州市人民医院浙江省江山市人民医院