BNIP3基因癌细胞论文范文

1材料与方法

1.1方法

1.1.1细胞培养及药物处理：MKN1细胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养、传代。实验用对数生长期细胞。细胞培养至60%汇合度时，分别加入2μmol/L或10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR处理液，对照组使用不含5⁃Aza⁃CdR的普通完全培养液。每隔24h换液1次，培养72h后处理细胞用于后续的相关检测。

1.1.2亚硫酸氢盐修饰DNA和BSP反应：采用Blood＆CellCultureDNAMiniKit试剂盒，按说明书步骤提取各组细胞基因组DNA。取500ngDNA按照试剂盒说明进行亚硫酸氢盐修饰及纯化。使未甲基化的胞嘧啶（C）转化成胸腺嘧啶（T），而甲基化的Cm不变。以修饰后基因组DNA为模板，用GoT⁃aqDNA聚合酶进行BNIP3基因启动子扩增。用MethPrimer软件设计甲基化引物，上游：5′⁃TTAAAGTGTTGAGATGAAAGATATG⁃3′，下游：5′⁃AATCCAAATCCAAATATCAAAATAC⁃3′，产物长度为288bp。反应条件为95℃10min，95℃30s、56℃30s、72℃30s进行35个循环，然后72℃延伸10min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，应用胶回收试剂盒回收，纯化目的片段，连接pGEM⁃T载体，4℃孵育过夜。取6μL连接产物转化JM109感受态大肠杆菌，蓝白筛选阳性克隆，送菌液测序。

1.1.3RT⁃PCR检测BNIP3基因表达：采用Axy⁃PrepTotalRNAMiniprepKit试剂盒提取各组细胞总RNA，逆转成cDNA后进行PCR实验，BNIP3引物序列：上游：5′⁃CCACCTCGCTCGCAGACACCAC⁃3′，下游：5′⁃GAGAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC⁃3′，长度为317bp。作为内参的人β⁃actin引物序列：上游：5′⁃CCAGATCATGTTTGAGACCT⁃3′；下游：5′⁃TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT⁃3′，长度为480bp。扩增反应条件：95℃5min变性，95℃复性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃暂时保存。实验重复3次。产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（Tanon⁃2500R）拍照及分析表达情况。

1.1.4染色质免疫沉淀：采用ChIP试剂盒按说明书进行如下操作：用1%甲醛PBS交联固定蛋白质－DNA复合物，加入交联终止液5min，2500r/min、4℃离心10min，PBS洗脱2次；加裂解液冰上裂解5min，酶法消化切割至200~1000bp的染色质小片段；之后，染色质与DNMT1特异性抗体及DNA/Pro⁃teinGAgorose4℃颠转过夜，洗脱蛋白/DNA复合物，纯化回收DNA。针对BNIP3启动子区的引物序列：上游：5′⁃CCGCGCCGCCTCCTCCGCCTCAC⁃3′；下游：5′⁃GCTCCGACCTCCGCTTTCCCACCGCC⁃3′。PCR扩增条件：95℃5min，95℃30s，59℃30s，72℃30s，72℃10min，30个循环。产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（Tanon⁃2500R）拍照及分析表达情况。

1.2统计学分析数据用x±s表示，采用SPSS13.0统计软件，组间比较采用t检验，甲基化率比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1MKN1细胞中BNIP3基因启动子区的甲基化状态

2.1.1BNIP3基因启动子区CpG岛序列分析：在ENSEMBLE上找到BNIP3基因启动子区的原始序列，利用MethPrimer分析，按照“长度超过200bp，GC含量大于50%，CpG出现率（观察值／预测值比例）≥0.6”的参数定义［8］，可以找到BNIP3基因启动子区自转录起始点上游966bp至下游86bp之间长度为1052bp的CpG岛。图1为BSP法拟分析其中长288bp、含14个CpG位点的DN段。

2.1.2BSP结果：以亚硫酸氢盐修饰后的DNA为模板行PCR，将PCR扩增产物连接T载体，转化增菌，PCR扩增鉴定阳性克隆。图2为随机挑取的5个克隆的菌液PCR鉴定结果，在约288bp处可见理想的目的条带。

2.1.3测序结果分析：阳性克隆进一步测序，将亚硫酸氢盐修饰后的序列与原序列进行对比，发现非CpG位点的“C”全部转化为“T”，证明亚硫酸氢盐修饰效果可信。扩增的BNIP3启动子区片段包含有14个CpG位点，与原始BNIP3基因序列比对，各CpG位点甲基化概率分别为100%、80%、100%、100%、80%、100%、100%、100%、80%、100%、100%、80%、100%、100%。见图3及图4。

2.25⁃Aza⁃CdR对MKN1细胞中BNIP3表达的影响采用不同浓度5⁃Aza⁃CdR处理MKN1细胞，作用72h后，对照组、2μmol/L5⁃Aza⁃CdR处理组和10μmol/L5⁃Aza⁃CdR组的BNIP3mRNA相对表达量分别为0.389±0.018，0.515±0.024，0.839±0.014。10μmol/L5⁃Aza⁃CdR组的BNIP3mRNA表达量较对照组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），见图5。

2.35⁃Aza⁃CdR对MKN1细胞中BNIP3基因启动子甲基化的影响10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR处理细胞72h后，BNIP3基因启动子甲基化状态有所逆转（图6），启动子区CpG位点甲基化率（74.2%±9.37%）与对照组（图4）甲基化率（94.3%±19.80%）比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4BNIP3启动子与DNMT1蛋白的结合用ChIP实验检测MKN1细胞中DNMT1与BNIP3启动子区DNA的结合。结果显示，在对照组可以检测到DNMT1与BNIP3启动子区DNA的结合，而10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR处理组与对照组相比DNMT1与BNIP3启动子区DNA的结合明显减少。见图7。

3讨论

DNA甲基化是表观遗传学修饰的重要作用方式之一，指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共价键结合一个甲基基团。越来越多的研究表明，DNA甲基化在癌症的发生机制中扮演重要角色。正常生理条件下，人类基因组中位于启动子区、富含CpG二核苷酸的CpG岛处于非甲基化状态，抑癌基因启动子区CpG岛过度甲基化可诱导基因转录失活、表达沉默。BNIP3是Bcl⁃2家族中BH3⁃only亚家族的成员，具有BH3结构域和跨膜区，属于促凋亡蛋白，通过促进线粒体通透性、转运开放和线粒体的损伤诱导凋亡。Murai等［3］在66%的结直肠癌和49%的胃癌中检测到BNIP3表达缺失。Abe等发现在几乎所有的胰腺癌组织和50%的胰腺癌细胞系中未检测到BNIP3的表达，其失活机制和DNA启动子区高度甲基化相关。

目前，国内关于BNIP3基因的甲基化研究基本都局限于甲基化特异PCR法，此方法的特点是灵敏度高，但只能对引物序列中少量CpG位点进行分析，具有一定的局限性。所以关于肿瘤细胞中BNIP3基因启动子区甲基化的具体位点还不清楚。BSP克隆测序法具有能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态的优势，是公认的DNA甲基化分析的金标准［7］。本研究利用MethPrimer软件分析了MKN1细胞中BNIP3基因CpG位点分布情况。结果显示，BNIP3基因启动子区自转录起始点上游966bp至下游86bp之间CpG位点分布密集，存在长度为1052bp的CpG岛。本研究中利用BSP克隆测序法对BNIP3基因启动子区中（+21bp~-267bp）长288bp、包含14个CpG位点的DN段进行甲基化水平的检测，甲基化率为80%~100%。因此，首次明确了胃癌MKN1细胞中BNIP3基因启动子区的甲基化位点，并检测到这些CpG位点呈现高度的甲基化。

我们进一步用去甲基化药物处理MKN1细胞，以明确启动子甲基化与BNIP3基因表达的关系。5⁃Aza⁃CdR是一种高效的DNMT抑制剂，它可与DNMT不可逆性结合，具有较强去甲基化作用，使表观遗传学沉默的基因去甲基化，逆转其恶性表型。本研究发现，对照组MKN1细胞中BNIP3表达缺失，10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR可诱导BNIP3mRNA表达明显增加，BNIP3基因的启动子区CpG位点甲基化概率较对照组明显下降，提示胃癌MKN1细胞中BNIP3基因表达缺失与启动子区高甲基化关系密切，该区域的CpG位点甲基化在调控基因转录中发挥重要作用。

DNA甲基化是由DNMT催化完成的。DNMT1催化甲基基团与胞嘧啶环的结合，维持DNA复制过程中的甲基化模式，在表观遗传修饰中发挥重要作用，其活性及表达水平与肿瘤发生密切相关。近年研究报道，DNMT1通过与靶基因启动子DNA序列结合，介导DNA甲基化，调节基因表达［12，13］。我们推测DNMT1是否参与介导BNIP3发生DNA甲基化的机制。我们利用ChIP技术检测DNMT1与BNIP3启动子区DNA的结合状态。结果显示，MKN1细胞中DNMT1能与BNIP3启动子区DNA结合。5⁃Aza⁃CdR能够明显抑制DNMT1与BNIP3启动子的结合。提示5⁃Aza⁃CdR降低DNMT1与BNIP3启动子区结合能力，部分逆转BNIP3的甲基化状态，是导致MKN1细胞中BNIP3表达上调的重要原因。

综上所述，本研究首次明确了胃癌MKN1细胞中BNIP3基因启动子区甲基化的具体位点，证实了MKN1细胞中BNIP3基因启动子区CpG位点存在高甲基化，BNIP3基因表达受启动子区DNA甲基化调控，甲基化的发生与DNMT1和BNIP3基因启动子结合有关。揭示了BNIP3基因启动子区DNA甲基化的机制，有助于从表观遗传学角度揭示胃癌的发病机制，为胃癌的基因治疗提供理论基础。

作者：沈薇刘坤隋璐邹丹胡金瑶单位：沈阳医学院病理生理教研室生理教研室2012级医学影像专业